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TBX3-Mutationsanalysen und Konstruktion einer Zelllinie für TBX2-Inhibitorscreenings

By Kathrin Fischer

Abstract

Die nahe verwandten T-box Transkriptionsfaktoren TBX2 und TBX3 werden in zahlreichen humanen Krebsarten überexprimiert, insbesondere in Brustkrebs und Melanomen. Die Überexpression von TBX2 und TBX3 hat verschiedene zelluläre Effekte, darunter die Unterdrückung der Seneszenz, die Förderung der Epithelialen-Mesenchymalen Transition sowie invasive Zellmotilität. Im Gegensatz dazu führt ein Funktionsverlust von TBX3 und der meisten anderen humanen T-box-Gene zu haploinsuffizienten Entwicklungsdefekten. Durch Sequenzierung des Exoms von Brustkrebsproben identifizierten Stephens et al. fünf verschiedene Mutationen in TBX3, welche allesamt die DNA-bindende T-box-Domäne betrafen. Die In-Frame-Deletion N212delN wurde zweimal gefunden. Aus der Anhäufung der Mutationen innerhalb der T-box-Domäne wurde geschlossen, dass TBX3 bei Brustkrebs ein Treibergen ist. Da Mutationen innerhalb der T-box-Domäne im Allgemeinen zu einem Funktionsverlust führen, aber die onkogene Aktivität von TBX3 meist auf eine Überexpression zurückzuführen ist, wurden die potentiellen Treibermutationen hinsichtlich einer verminderten oder gesteigerten TBX3-Funktion geprüft. Getestet wurden zwei In-Frame Deletionen, eine Missense- sowie eine Frameshift-Mutante bezüglich der DNA-Bindung in vitro und der Zielgen-Repression in Zellkultur. Zusätzlich wurde eine in silico Analyse der im The Cancer Genome Atlas (TCGA) gelisteten somatischen TBX-Brustkrebsmutationen durchgeführt. Sowohl die experimentelle als auch die in silico Analyse zeigten, dass die untersuchten Mutationen vorwiegend zum Verlust der TBX3-Funktion führen. Um den Mechanismus der Genrepression durch TBX3 besser zu verstehen, wurden weitere TBX3-Mutanten bezüglich ihrer Wirkung auf die p21-Promotoraktivität (p21-Luc-Reporter und endogene p21-Expression) analysiert. Wildtypische p21-Luc-Repression zeigten die zwei Mutationen S674A (Phosphorylierung) und D275K (SUMOylierung), welche posttranslationale Modifikationen verhindern, sowie die Interaktion mit dem Tumorsuppressor Rb1 unterbindende M302A/V304A-Mutation. Erstaunlicherweise war die endogene p21-Repression dieser Mutanten stärker als die des wildtypischen TBX3-Proteins. Alle drei Mutationen führten zu einer Stabilisierung des TBX3-Proteins. Die ursprünglich in Patienten mit Ulna-Mamma Syndrom identifizierte, DNA-bindungsdefekte Y149S-Mutante konnte weder p21-Luc noch endogenes p21 reprimieren. Mutationen in potentiellen Interaktionsdomänen für die Bindung der Co-Repressoren Groucho und C-terminalem Bindeprotein zeigten sowohl auf p21-Luc als auch auf endogenes p21-Gen wildtypische Repressoraktivität, so dass diese Co-Repressoren in COS-7-Zellen wahrscheinlich nicht an der Repression dieses Gens beteiligt sind. Da TBX2 und TBX3 interessante Ziele zur direkten Krebsbekämpfung darstellen, sollte ein zelluläres Reportersystem zur Identifikation TBX2-inhibierender, pharmakologisch aktiver Substanzen etabliert werden. Dazu sollte eine stabile Zelllinie mit vom p21-Promotor reguliertem d2EGFP-Reporter und Doxyzyklin-induzierbarem TBX2-Protein erzeugt werden, da ektopische Expression von TBX2 genetische Instabilität und Toxizität induzieren kann. In dieser Zelllinie sollte die TBX2-Expression zur Reduktion der d2EGFP-Fluoreszenz führen. Zur Erzeugung der Zelllinie wurden die folgenden drei Konstrukte Schritt-für-Schritt stabil in das Genom der Zielzelllinie COS-7 integriert: pEF1alpha-Tet3G, pTRE3G-TBX2 und p21-d2EGFP. Während die Herstellung der doppelt stabilen COS-7-Zelllinie gelang, scheiterte die Herstellung der dreifach stabilen Zelllinie.The closely related T-box transcription factors TBX2 and TBX3 are frequently overexpressed in various types of human cancer, in particular breast cancer and melanoma. The overexpression of TBX2 and TBX3 can have several cellular effects, among them suppression of senescence, promotion of epithelial-mesenchymal transition and invasive cell motility. In contrast, loss-of-function of TBX3 and most other human T-box genes causes haploinsufficiencency developmental defects. Stephens and colleagues identified five different mutations in TBX3 by exome sequencing of breast tumor samples, all effecting the DNA-binding T-box domain. One in-frame deletion of a single amino acid, N212delN, was observed twice. Due to the clustering of the mutations to the T-box domain, TBX3 was inferred to be a driver gene in breast cancer. Since mutations in the T-box domain generally cause loss-of-function and because the tumorigenic action of TBX3 has generally been attributed to overexpression, the putative driver mutations were analyzed whether they had loss- or gain-of-function properties. Two in-frame deletions, one missense and one frameshift mutant protein were tested for DNA binding in vitro and for target gene repression in cell culture. In addition, an in silico analysis of somatic TBX mutations in breast cancer collected in The Cancer Genome Atlas (TCGA) was performed. Both, the experimental and the in silico analysis indicate that the observed mutations predominantly cause loss-of TBX3 function. For understanding the mechanism of TBX3-dependent gene repression, additional TBX3 mutants were analyzed for their repression of p21-promotor activity (p21-Luc reporter and endogenous p21-expression). Wild-typic p21-Luc repression was observed for two mutations that interfere with posttranslational modification D275K (SUMOylation) and S674A (phosphorylation) as well as for the M302A/V304A mutant that prevents interaction with the Rb1 tumor suppressor. Surprisingly, the repression of the endogenous p21-activity by these mutant proteins was stronger than wild-type TBX3. All three mutations enhanced TBX3 protein stability. The binding deficient mutant Y149S was first detected in patients with ulnar-mammary syndrome. The mutant failed in repressing both, p21-Luc and endogenous p21. Mutations in potential interaction domains for binding of the corepressors Groucho and C-terminal binding protein showed wild-typic repression of p21-Luc as well as of endogenous p21. Apparently, these corepressors are not involved in p21-repression in COS-7 cells. As TBX2 and TBX3 are potential targets for anti-cancer treatment, I tried to generate a cellular reporter system for identifying pharmacologically active substances that can inhibit TBX2. For this purpose, a constitutive p21-d2EGFP reporter and doxycline-inducible TBX2 were used as ectopic TBX2 expression causes genomic instability and toxicity. In such a cell line, expression of TBX2 should result in a reduction of d2EGFP fluorescence. For generation of this cell line the following three constructs were integrated step-by-step into the genome of the cell line COS-7: pEF1alpha-Tet3G, pTRE3G-TBX2 and p21-d2EGFP. While generation of the double stable COS-7 cell line succeeded, generation of the triple stable cell line failed

Topics: TBX2, TBX3, p21, Brustkrebs-Treibermutationen, Tet-On-System, TBX2, TBX3, p21, breast cancer driver mutations, Tet-On system, Life sciences
Publisher: 10: Biologie. 10: Biologie
Year: 2015
OAI identifier: oai:ubm.opus.hbz-nrw.de:4123
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