Transport of nanoparticles into polymersomes : a minimal model system of particles passage through biological membranes

Abstract

This thesis focuses on the design and characterization of a novel, artificial minimal model membrane system with chosen physical parameters to mimic a nanoparticle uptake process driven exclusively by adhesion and softness of the bilayer. The realization is based on polymersomes composed of poly(dimethylsiloxane)-b-poly(2-methyloxazoline) (PMDS-b-PMOXA) and nanoscopic colloidal particles (polystyrene, silica), and the utilization of powerful characterization techniques. rnPDMS-b-PMOXA polymersomes with a radius, Rh ~100 nm, a size polydispersity, PD = 1.1 and a membrane thickness, h = 16 nm, were prepared using the film rehydratation method. Due to the suitable mechanical properties (Young’s modulus of ~17 MPa and a bending modulus of ~7⋅10-8 J) along with the long-term stability and the modifiability, these kind of polymersomes can be used as model membranes to study physical and physicochemical aspects of transmembrane transport of nanoparticles. A combination of photon (PCS) and fluorescence (FCS) correlation spectroscopies optimizes species selectivity, necessary for a unique internalization study encompassing two main efforts. rnFor the proof of concepts, the first effort focused on the interaction of nanoparticles (Rh NP SiO2 = 14 nm, Rh NP PS = 16 nm; cNP = 0.1 gL-1) and polymersomes (Rh P = 112 nm; cP = 0.045 gL-1) with fixed size and concentration. Identification of a modified form factor of the polymersome entities, selectively seen in the PCS experiment, enabled a precise monitor and quantitative description of the incorporation process. Combining PCS and FCS led to the estimation of the incorporated particles per polymersome (about 8 in the examined system) and the development of an appropriate methodology for the kinetics and dynamics of the internalization process. rnThe second effort aimed at the establishment of the necessary phenomenology to facilitate comparison with theories. The size and concentration of the nanoparticles were chosen as the most important system variables (Rh NP = 14 - 57 nm; cNP = 0.05 - 0.2 gL-1). It was revealed that the incorporation process could be controlled to a significant extent by changing the nanoparticles size and concentration. Average number of 7 up to 11 NPs with Rh NP = 14 nm and 3 up to 6 NPs with Rh NP = 25 nm can be internalized into the present polymersomes by changing initial nanoparticles concentration in the range 0.1- 0.2 gL-1. Rapid internalization of the particles by polymersomes is observed only above a critical threshold particles concentration, dependent on the nanoparticle size. rnWith regard possible pathways for the particle uptake, cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) has revealed two different incorporation mechanisms depending on the size of the involved nanoparticles: cooperative incorporation of nanoparticles groups or single nanoparticles incorporation. Conditions for nanoparticle uptake and controlled filling of polymersomes were presented. rnIn the framework of this thesis, the experimental observation of transmembrane transport of spherical PS and SiO2 NPs into polymersomes via an internalization process was reported and examined quantitatively for the first time. rnIn a summary the work performed in frames of this thesis might have significant impact on cell model systems’ development and thus improved understanding of transmembrane transport processes. The present experimental findings help create the missing phenomenology necessary for a detailed understanding of a phenomenon with great relevance in transmembrane transport. The fact that transmembrane transport of nanoparticles can be performed by artificial model system without any additional stimuli has a fundamental impact on the understanding, not only of the nanoparticle invagination process but also of the interaction of nanoparticles with biological as well as polymeric membranes. rnDie vorliegende Doktorarbeit behandelt die Entwicklung und die Charakterisierung eines neuartigen, künstlichen Minimalmodells eines Membransystems, das den physikalischen Prozess der Nanopartikelaufnahme allein durch Adhäsionskräfte und Elastizität der Membran imitiert. Dieses Minimalmodell besteht zum einen aus Polymersomen, die aus dem Blockcopolymer Poly(dimethylsiloxan)-Block-Poly(2-methyloxazolin) (PDMS-b-PMOXA) gebildet werden, und zum anderen aus Nanopartikeln (Polystyrol, Silica). Es wurde mit Hilfe von geeigneten Charakterisierungs¬methoden untersucht.rnEs wurden Polymersome aus PDMS-b-PMOXA mit einem Radius (Rh) ~ 100 nm und einer Größendispersität von PD = 1.1 mittels der Filmbildemethode hergestellt. Die Dicke der Doppelschichtmembran beträgt 16 nm. Aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften (Elastizitätsmodul von ~ 17 MPa und Biegemodul von ~7⋅10-8 J), ihrer Langzeitstabilität und ihrer Modifizierbarkeit eignen sich diese Polymersome als Modellmembrane, an denen die physikalischen und physikochemischen Aspekte des transmembranen Transport von Nanopartikeln untersucht wurden. Als Methoden der Wahl wurden dynamische Lichtstreuung (PCS) und Fluoreszenz¬korrelationsspektroskopie (FCS) gewählt. rnAls Demonstration des Prinzips wurde zuerst die Wechselwirkung zwischen Nanopartikeln (Rh NP SiO2 = 14 nm, Rh NP PS = 16 nm; cNP = 0.1 gL-1) und Polymersom (Rh P = 112 nm; cP = 0.045 gL-1) mit festgelegten Größen und Konzentrationen untersucht. In Lichtstreuexperimenten wurde ein veränderter Formfaktor der Polymersome beobachtet, der die präzise Verfolgung und quantitative Beschreibung des Aufnahmeprozesses ermöglichte. Die Kombination von PCS und FCS erlaubte die Abschätzung der Anzahl der aufgenommenen Partikel pro Polymersom (ca. 8 Partikel) und die Entwicklung einer geeigneten Methodik für die kinetischen und dynamischen Aspekte des Aufnahmeprozesses. rnDes Weiteren wurden die experimentellen Ergebnisse mit theoretischen Studien verglichen. Sowohl Größe als auch Konzentration der Nanopartikel wurden als die wichtigsten Systemvariablen bestimmt (Rh NP = 14 - 57 nm; cNP = 0.05 - 0.2 gL-1). Es wurde gezeigt, dass der Aufnahmeprozess maßgeblich durch Variation der Nanopartikelgröße und –Konzentration beeinflusst werden kann. Bei Nanopartikelkonzentrationen von 0.1 – 0.2 gL-1 wurden durchschnittlich 7 bis 11 Nanopartikel mit Rh = 14 nm und 3 bis 6 Nanopartikel mit Rh = 25 nm in die Polymersome aufgenommen. Der Aufnahmeprozess wurde außerdem nur oberhalb einer kritischen Nanopartikelkonzentration beobachtet, die wiederum abhängig von der Nanopartikelgröße ist. rnMit Hilfe der Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie (cryo-TEM) wurden zwei unterschiedliche Aufnahmemechanismen gefunden, die von der Größe der eingesetzten Nanopartikel abhängen: gemeinsame Aufnahme von Nanopartikeln in Gruppen oder Aufnahme von einzelnen Nanopartikeln. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen Nanopartikelaufnahme und somit das kontrollierte Füllen von Polymersomen möglich ist. rnIm Rahmen dieser Doktorarbeit wurde somit erstmalig der transmembrane Transport von sphärischen Polystyrol- und Silica-Nanopartikeln in Polymersome beobachtet und quantitativ untersucht. Die experimentellen Arbeiten, die dieser Doktorarbeit zu Grunde liegen, werden Einfluss auf die Entwicklung von Zellmodellsystemen haben und dadurch erheblich das Verständnis von transmembranen Transportprozessen verbessern. Die in dieser Arbeit vorgestellten experimentellen Ergebnisse zeigen, dass transmembraner Transport von Nanopartikeln an künstlichen Modell¬systemen ohne zusätzliche Impulse möglich ist. Dies hat grundlegenden Einfluss auf das Verständnis des Prozesses der Nanopartikelaufnahme sowie auf die Wechselwirkung von Nanopartikeln mit biologischen und auch polymeren Membranen. r

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