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Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

By Swati Shetty

Abstract

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.To carry out functional studies on the mouse genome, our laboratory has generated a library of Embryonic Stem Cell (ESC) clones harboring random nested chromosomal deletions – DELES library. This library contains deletions covering ~ 25% of the mouse genome. In the lab, we are interested in identifying novel hematopoietic cell fate determinants using this resource. A primary screen using benzidine to demonstrate the presence of hemoglobin in embryoid bodies (EBs) was able to identify several DELES clones exhibiting abnormal hematopoietic phenotype. Since this assay only tested for the presence of hemoglobin, the goal of my project is to establish a robust in vitro ESC differentiation assay to monitor the hematopoietic potential of DELES clones. My hypothesis is that the hematopoietic differentiation assay published by Dr. Keller can be used to observe hematopoietic commitment of the DELES clones. Using QRT-PCR and FACS assays I was able to monitor the kinetics of hematopoietic differentiation by observing the expression of hematopoietic genes and surface markers including CD41, C-KIT, RUNX1, GATA2, CD45, β-GLOBIN 1 and TER-119. This assay will be used to validate the hematopoietic potential of the candidate DELES clones identified in the primary screen. My secondary project aims to use the same retro-viral Cre-loxP strategy used for the DELES library, in order to generate a library of KBM-7 leukemic cells harboring nested chromosomal deletions. My goal here is to test if the human near haploid KBM-7 cell line can be exploited using the DELES approach to create this library. The library of KBM-7 clones will be used to delineate the molecular activities of potential anti-leukemic drugs that we have identified in the lab to inhibit cell growth in several patient-derived acute-myeloid leukemia specimens. It will also allow me to identify molecular signaling pathways that, when genetically disrupted, can confer resistance to these drugs

Topics: cellules souches embryonnaires, différenciation hématopoïétique, cellules KBM-7, suppressions chromosomiques, Embryonic stem cells, hematopoietic differentiation, KBM-7 cells, chromosomal deletions, Biology - Molecular / Biologie - Biologie moléculaire (UMI : 0307)
Year: 2016
OAI identifier: oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/13857

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