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Caractérisation d’inhibiteurs d’anhydrase carbonique IX, études de complexes supramoléculaires et interactions moléculaires par résonance plasmonique de surface

By Tiphaine Florent

Abstract

Carbonic anhydrase (CA) IX expression is increased upon hypoxia and has been proposed as a therapeutic target since it has been associated with poor prognosis, tumor progression and pH regulation. A new class of human carbonic anhydrase IX (hCA IX) inhibitors, diarylpyrazole sulfonamide derivatives, has been synthesized in our team. These compounds have a very limited water solubility which limits their pharmaceutical development. The complexation with cyclodextrins (CDs) offers the possibility to improve their solubility without affecting their original structure and has proved to be one of the most effective. The studies of the complexes formed between our compounds and various CDs have been performed, in order to choose the most appropriate CD. We investigate by NMR and capillary electrophoresis the complexes formed between six original diarylpyrazole sulfonamide derivatives and six CDs (native -, - and - CDs, hydroxypropylated HP--CD, methylated Me--CD or amino NH2--CD) at physiological pH. Futhermore, as these compounds have a chiral center, it was essential to separate their enantiomers and verify their optical purities before envisaging the study of their pharmacological activity. The enantiomeric purification was performed by three separative methods, the high performance liquid chromatography, the supercritical fluid chromatography and the capillary electrophoresis. This study permit to obtain optically pure compound in order to determine affinity of carbonic anhydrase. To determine the affinities of derivatives with isoforms, we performed first a comparison of three label-free methods for quantitative assessment of binding strength between carbonic anhydrase II and sulfonamides derivatives. The formation constants have been determined by surface plasmon resonance, isothermal titration calorimetry and thermal shift assay, which characterize the interaction between two partners. This study was useful to select and to validate the surface plasmon resonance (SPR) for the molecular interaction between carbonic anhydrases and all our derivatives. Affinities of sixteen compounds for three carbonic anhydrase isoforms (CA II, IX and XII) were then determined by SPR. These compounds have nanomolar affinities for three isoforms. Two compounds have affinities with great interest for the isoform CA IX, and a good selectivity CA IX versus CA II and should be considered as lead compounds. Additionally, some of optically pure compounds have shown an enantioselectivity for the AC isoformsL’anhydrase carbonique IX (AC IX h) est une enzyme souvent associée à un mauvais pronostic, à la progression tumorale et à la régulation du pH extracellulaire des cellules tumorales sur un plan moléculaire. L’AC IX est très peu exprimée dans les tissus sains mais par contre, elle est surexprimée au sein de la masse tumorale, ce qui permet de la qualifier comme une cible thérapeutique potentielle. Une nouvelle classe d’inhibiteurs d’anhydrase carbonique IX a été conçue et synthétisée par notre équipe. Cette série de composés présente une solubilité aqueuse faible, limitant ainsi son développement pharmaceutique. La complexation de ces composés avec des cyclodextrines offre la possibilité d’améliorer leur solubilité et leur biodisponibilité sans affecter leur structure originale. Des études de complexation entre nos composés et diverses cyclodextrines ont été réalisées, afin de déterminer le complexe supramoléculaire le plus adéquat. Les études des complexes Analyte / Cyclodextrine ont été réalisées par deux techniques complémentaires, la résonance magnétique nucléaire et l’électrophorèse capillaire. La complexation de six sulfonamidodiarylpyrazoles originaux avec six cyclodextrines (-, - et - CDs, hydroxypropyle HP--CD, méthyle Me--CD ou amino NH2--CD) a été étudiée au pH physiologique. Les constantes de complexation, la stœchiométrie et l’étude structurale des complexes ont alors été déterminées.Par ailleurs, la présence d’un centre d’asymétrie dans la série des alcools secondaires, synthétisés sous leurs formes racémiques, a orienté nos travaux vers le développement de méthodes séparatives à l’échelle préparative afin de disposer de quantités suffisantes d’énantiomères permettant la détermination de leurs affinités pour la cible. Les séparations chirales ont été mises au point par chromatographie liquide haute performance, par chromatographie en phase supercritique ou par électrophorèse capillaire. La caractérisation de quatre analytes vis-à-vis de l’anhydrase carbonique II (AC II) a été réalisée, dans un premier temps, par des études d’interaction moléculaire utilisant des méthodes biophysiques qui ne nécessitent pas de marquage des partenaires, la résonance plasmonique de surface, la calorimétrie de titration isotherme et la thermal shift assay. L’objectif de cette comparaison était de valider les résultats obtenus mais aussi de sélectionner la méthode d’analyse permettant l’étude d’une grande série de composés avec l’isoforme d’intérêt (AC IX). Les résultats obtenus nous ont conduits à choisir la résonance plasmonique de surface (RPS) comme technique de choix pour l’étude de l’affinité des sulfonamidodiarylpyrazoles. Les affinités de seize composés pour trois isoformes (AC II, IX et XII) ont ensuite été déterminées par RPS. Des affinités de l’ordre du nanomolaire ont été obtenues pour les trois isoformes. De cette étude, deux composés possédant une affinité intéressante pour l’AC IX et une sélectivité AC IX versus AC II ont été selectionnés. De plus, l’étude de l’affinité des composés optiquement purs a permis de mettre en évidence une énantioselectivité isoforme dépendante

Topics: Liquid and supercritical chromatography, Capillary electrophoresis, Cyclodextrins, Chiral separation, Thermal shift assay, Isothermal titration calorimetry, Surface plasmon resonance, Molecular interaction, Carbonic anhydrase, Chromatographie en phase liquide et en phase supercritique, Electrophorèse capillaire, Résonance plasmonique de surface, Calorimétrie de toitration isotherme, Cyclodextrines, Séparation chirale, Anhydrase carbonique, Sulfonamidodiarylpyrazole, Interaction moléculaire, [ SDV.MHEP ] Life Sciences [q-bio]/Human health and pathology
Publisher: HAL CCSD
Year: 2014
OAI identifier: oai:HAL:tel-01207424v1
Provided by: Thèses en Ligne

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