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Développement d’une méthode de traçage mixte pour Aureobasidium pullulans souche Ach 1-1 et souche 1113-5,deux agents antagonistes des maladies fongiques des pommes en conservation

By Adil EL HAMOUCHI

Abstract

Aureobasidium pullulans strains Ach 1-1 and 1113-5 are two efficient biocontrol agents against Botrytiscinerea and Penicillium expansum on stored apples. In the present work, a monitoring system allowing their identification and quantification has been developed. The used methodology consisted in the development of specific molecular markers for both strains and a semi-selective medium which facilitate the isolation and counting colonies of strains Ach 1-1 and 1113-5. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique has been applied to a collection of 15 strains of A. pullulans, including the Ach 1-1 and 1113-5 strains. Five specific RAPD fragments have been amplified for strain Ach 1-1 and three others for strain 1113-5. Among them, a fragment of 528 bp specific to strain Ach 1-1 (generated with the OPR-13 RAPD primer) and another one of 431 bp specific to strain 1113-5 (amplified with the OPQ-03 RAPD primer) have been selected, cloned, sequenced, and used to design sequence-characterized amplified region (SCAR) primers. Four different SCAR markers have been amplified: three specific to strain Ach 1-1 (157 bp, 190 bp and 388 bp) and one specific to strain 1113-5 (431 bp). These SCAR primers can clearly identify strains Ach 1-1 and 1113-5 among 14 strains of A. pullulans and among eight yeast strains commonly present on the surface of apples. Their selectivity has been also tested using DNA extracted from epiphytic microflora of the apple surface. As a semi-selective medium, the PDA medium supplemented with 0.5 mg/L Euparen, 1mg/L Sumico, 2.5mg/L Hygromycin B, 30 mg/L Streptomycin sulphate, and 1 mg/L Cycloheximide has been selected. This medium inhibited the development of the air microflora and appeared highly toxic for the epiphytic microflora of apple surface without altering the growth of the targeted strains Ach 1-1 and 1113-5. The combination of the plating technique on semi-selective medium and the identification of the colonies by PCR amplification of SCAR markers of 190 bp and 431 bp, respectively specific to A. pullulans strain Ach 1-1 and strain 1113-5, provides a valuable monitoring tool to specifically identify and quantify our targets strains. This monitoring tool has been used to evaluate their population dynamics on apple surface under cold storage conditions. Using this mixed monitoring method, we have highlighted that the population density of strain Ach 1-1 and strain 1113-5 on apple surface has been respectively 1.43x104 ufc/cm2 and 1.47x104 ufc/cm², two hours after their application on apples at the concentration of 107 ufc/mL. After two months storage at 4°C, these two populations densities were reduced by 58% and 66% respectively for the strain Ach 1-1 and strain 1113-5. This technique allowed also to demonstrate that the natural population of A. pullulans on apples surface represented 1% of the number of A. pullulans recovered on apples treated by strain Ach 1-1 and 8% in the case of strain 1113-5.Aureobasidium pullulans souche Ach 1-1 et souche 1113-5 sont deux agents de biocontrôle efficaces contre Botrytis cinerea et Penicillium expansum, respectivement responsables de la pourriture grise et bleue des pommes en conservation. Dans le présent travail, un système de traçage permettant d’identifier spécifiquement nos deux souches antagonistes et de les quantifier parmi la microflore naturellement présente à la surface des fruits a été développé. La méthodologie utilisée consistait au développement de marqueurs moléculaires spécifiques pour nos deux souches étudiées et d’un milieu de culture semisélectif permettant de faciliter l’isolement et le comptage des colonies des souches Ach 1-1 et 1113-5.La technique de marquage moléculaire RAPD a été appliquée sur une collection de 15 souches d’A. pullulans, y compris les souches Ach 1-1 et 1113-5. Cette technique nous a permis d’identifier cinq fragments RAPD spécifiques chez la souche Ach 1-1 et trois autres chez la souche 1113-5. Parmi eux, un fragment de 528 pb spécifique à la souche Ach 1-1 (généré avec l’amorce RAPD OPR-13) et un autre de 431 pb spécifique à la souche 1113-5 (amplifié avec l’amorce RAPD OPQ-03) ont été sélectionnés, clonés et séquencés. Leurs séquences nous ont servit de base pour concevoir des amorces SCAR. Quatrecouples d’amorces SCAR ont étés sélectionnés pour leur capacité à générer des marqueurs SCAR : trois spécifiques à la souche Ach 1-1 (157 pb, 190 pb et 388 pb) et un spécifique à la souche 1113-5 (431 pb). Ces amorces SCAR peuvent identifier de façon spécifique les souches Ach 1-1 et 1113-5 parmi une collection de 14 souches d’A. pullulans et huit autres souches de levures communément présentes à la surface de pommes. La sélectivité de nos amorces SCAR a été aussi testée sur de l’ADN extrait à partir de la microflore épiphytique des pommes.Comme milieu de culture semi-sélectif, le milieu PDA amendé avec 0,5 mg/L d’Euparen , 1 mg/L de Sumico, 2,5 mg/L d’Hygromycine B, 30 mg/L de Streptomycine sulfate et 1 mg/L de Cycloheximide a été sélectionné. Ce milieu a permis l’inhibition totale du développement de la microflore de l’air et parait très toxique vis-à-vis de la microflore épiphytique de la surface des pommes.La combinaison entre la technique d’étalement sur un milieu de culture semi-sélectif et l’identification des colonies par amplification PCR des marqueurs SCAR de 190 pb et de 431 pb, respectivementspécifiques aux souches Ach 1-1 et 1113-5, nous a fourni un outil de traçage plus précis pour étudier la dynamique des populations de ces deux agents de biocontrôle à la surface de pommes en condition de conservation en chambre froide.L’utilisation de cette procédure de traçage mixte nous a permis de mettre en évidence une densité de population de 1,43x104 ufc/cm2 et de 1,47x104 ufc/cm² respectivement pour la souche Ach 1-1 et 1113-5,deux heures après leur application sur pommes avec une concentration de 107ufc/mL. Après deux mois de stockage à 4°C, ces deux populations ont chuté de 58% et 66 % respectivement pour la souche Ach 1-1 et la souche 1113-5. Cette technique nous a également permis de montrer que la population naturelle en A. pullulans à la surface des pommes représentait 1% du nombre d’A. pullulans récupérées à la surface des pommes traitées avec la souche Ach 1-1 et 8% dans le cas de la souche 1113-5

Topics: Biological control, Monitoring, Postharvest, RAPD, SCAR, Semi-selective medium, contrôle biologique, traçage, postrécolte, RAPD, SCAR, milieu semi-sélectif, MESH : contrôle biologique, traçage, postrécolte, RAPD, SCAR, milieu semi-sélectif, MESH : Biological control Monitoring Postharvest RAPD SCAR Semi-selective medium, [ SDV ] Life Sciences [q-bio]
Publisher: HAL CCSD
Year: 2011
OAI identifier: oai:HAL:tel-01298076v1
Provided by: Thèses en Ligne

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