Effects of conventional and microwave treatments on inhibitory activity and structural conformation of trypsin inhibitor protein

Abstract

Food processing and preservation techniques provide high quality nutritive food, reduce the risk of contracting food-borne diseases and increase the shelf life of food products. Processing techniques further increase the digestibility of food, resulting in greater bioavailability of the nutrients and also in the elimination of undesirable factors. Though extensive studies have been performed using various commercial processing methods such as sterilization, pasteurization, autoclaving, extrusion, homogenization, blanching, batch boiling, steam injection, ultra-high temperature (UHT), high temperature and pressure combination, ohmic heating and high pressure processing (HPP), for producing quality food, limited knowledge is available in terms of the effects of processing at atomic and molecular level. Thus, the studies to understand the changes at molecular level could help industrialists to design processing methods with increased nutritive and sensory appeal of food products.In this study, the effects of conventional thermal and microwave treatments on raw soymilk samples for the inactivation of soybean trypsin inhibitors were evaluated. In- vitro protein digestibility (IVPD) studies were also conducted for understanding the effects of aforementioned processing techniques on soymilk proteins. The levels of microwave processing (70⁰C, 85⁰C and 100⁰C for 2, 5, 8 min) and conventional treatment (70⁰C, 85⁰C and 100⁰C for 10, 20, 30 min) were optimized using Response Surface Methodology (RSM).Molecular dynamics (MD) simulation modelling techniques have been applied to explore and visualize the behavior of proteins, at ambient conditions and under the influence of external electric field stress, temperature and time. Soybean trypsin inhibitor (STI) protein was selected for MD simulations. By performing these simulations under the electric field strength of 0.5 V/nm, a valuable insight into the effects of electric field on protein conformation was noted and evaluated using through Root Mean Square Deviation (RMSD), Solvent Accessible Surface Area (SASA) and Ramachandran plot analysis. It was observed that STI has an unusual β-sheet structural stability under the influence of oscillating electric fields. Ramachandran plots were also used to analyze the stability of the molecules obtained on treatment with temperatures (300 K to 393 K) and oscillating electric fields (0.5 V/nm at 2.45 GHz).The experimental results showed that the in-vitro protein digestibility increased with increase in time and temperature during microwave processing and conventional thermal processing. Similarly reduced trypsin inhibitor activity (TIA) values were obtained with an increase in time and temperature of the processing conditions. Therefore, microwave processing can be used as a potential alternative method of processing to improve the overall quality of soymilk. MD simulations have been introduced as a tool to visualize the changes in the stability of secondary protein structures during various processing conditions of time and temperature. The studies also established the relation between various processing methods and conformations of secondary structure of proteins. The solvent accessible area of cysteine residues increased with an increase in the temperature (300 K to 394 K), both in the presence and absence of the oscillating electric field, influencing the disulphide bridge stability. The results showed that the core tryptophan residues of the STI protein increased significantly by changing the conformation of the secondary structure during conventional heating and microwave processing, thus affecting the functional properties of the protein.Les techniques de traitement et conservation des denrées périssables permettent de fabriquer des aliments nutritif et salubre, et d'augmenter la durée de conservation des produits alimentaires. Certaines de ces techniques permettent d'accroître la digestibilité des aliments, entraînant une plus grande biodisponibilité des nutriments et l'élimination de facteurs indésirables. Bien que plusieurs études ont été effectuées pour établir la validité de diverses méthodes de traitement comme la stérilisation, la pasteurisation, l'extrusion, l'homogénéisation, le blanchiment, l'injection de vapeur, les ultra-hautes températures, l'utilisation combinée de hautes températures et pressions, le chauffage ohmique et les traitements à très haute pressions, on constate que l'état de la connaissance sur les effets de la transformation au niveau atomique et moléculaire des aliments est limité. Une meilleure compréhension des changements au niveau moléculaire causés par les procédés de transformation est nécessaire pour développer de nouveaux procédés industriels pour la fabrication d'aliments nutritifs, savoureux et sécuritaires. Dans cette étude, les effets des traitements thermiques conventionnels et par micro-ondes sur des échantillons de lait de soja brut pour l'inactivation des inhibiteurs de la trypsine ont été évalués. Des essais sur la digestibilité in-vitro des protéines ont été menés pour mieux comprendre les effets de ces procédés sur les protéines de lait de soja. Les traitements par micro-ondes (70⁰C, 85⁰C et 100⁰C pour 2, 5, et 8 min) ont été comparés aux traitements thermiques conventionnels (70⁰C, 85⁰C et 100⁰C pour 10, 20, et 30 min) et optimisés en utilisant la méthodologie des surfaces de réponses.Des techniques de simulation de la dynamique moléculaire ont été utilisées pour étudier et visualiser le comportement des protéines exposées à des stresses externes causés par les champs micro-ondes, les températures élevées et les durées de traitement. La protéine de soya qui agit comme inhibiteur de l'activité enzymatique de la trypsine et de la chymotrypsine a été utilisée pour les simulations MD. Lors de ces simulations, l'intensité du champ électromagnétique était de 0,5 V/nm et la fréquence de 2450 MHz. Cette simulation a permis d'avoir un aperçu de l'effet du champ électromagnétique sur la conformation des protéines. Ces effets ont été évalués et comparés par le biais des déviations de l'écart quadratique moyen (RMSD), les surfaces de la zone accessible aux solvants (SASA) et les tracés de Ramachandran. Les tracés de Ramachandran ont également été utilisés pour analyser la stabilité des molécules obtenues après le traitement à des températures allant de 300 à 393 K et exposées aux microondes. Les résultats ont démontré que la digestibilité in-vitro des protéines augmentait avec l'augmentation du temps et de la température de traitement (micro-ondes et thermique conventionnel). De plus, l'activité d'inhibiteur de trypsine (AIT) a diminué avec l'augmentation du temps et de la température des traitements. Le sur-traitement thermique conventionnel requis pour la désactivation des inhibiteurs de trypsine a endommagé d'autres protéines du soya et du fait réduit sa qualité nutritive. Du fait, cette étude a démontré que le traitement par micro-ondes du lait de soya permettaient de fabriquer un lait de meilleur qualité. De plus, il a été observé que les surfaces de la zone accessible aux solvants des résidus de cystéine augmentaient avec l'augmentation de la température (300 K à 394K), à la fois en présence et en l'absence du champ électrique oscillant, et influencé la stabilité des ponts disulfure. On a trouvé que les résidus de noyaux de tryptophane de la protéine STI avaient augmenté de manière significative en modifiant la conformation de la structure secondaire, lors du traitement thermique conventionnel et par traitement de micro-ondes, ce qui a altéré les propriétés fonctionnelles de la protéine