Article thumbnail
Location of Repository

Analisi genetica e citologica di due linee mutanti maschio-sterile di Drosophila melanogaster

By Fabiana Fabbretti

Abstract

Spermatogenesis, the production of male functional gametes from germinal stem cells, represents one of the most dramatic examples of cell differentiation. The availability of Drosophila melanogaster mutants defective for specific spermatogenesis stages, the short Drosophila life cycle, the availability of genetic resources, like a fully sequenced genome, and the gene and pathway conservation with humans, make this insect particularly suitable to study the genetic control of the spermatogenesis process. The aim of my PhD research project was the analysis of two mutant strains (ms(2)Z5584 and ms(2)Z1168) belonging to a unique collection of 13 ethyl-methansulfonate (EMS)-induced male sterile recessive mutants identified in a large screening for male-sterile mutations on chromosome 2 and 3 (Wakimoto et al., 2004). From a preliminary cytological screen of mutations, a general and common aberrant phenotype affecting the entry into and progression of the meiotic cell cycle was identified: mutants skipped one or both meiotic divisions but carried out the differentiation of spermatids although with anomalies. The ms(2)Z5584 mutant strain was previously genetically and cytologically characterized and a point mutation in rae1 gene was identified as responsible of the aberrant phenotypes (Volpi et al., 2013). Starting from that evidences, I confirmed the identification of rae1 as the gene underlying the ms(2)Z5584 mutant phenotype, by RNAi silencing of the wild type rae1. Then, I uncovered the localization pattern of RAE1 during meiotic cell cycle by GAL4/UAS system allowing the expression of UASGFP-rae1 transgene under both testis-specific and constitutive drivers. Finally, I performed the phenotype rescue of the ms(2)Z5584 mutant by using of UASGFP-rae1 transgene. The ms(2)Z1168 mutant strain was cytologically characterized by immunohistochemistry technique using antibodies against several structures involved in male meiosis and confocal microscopy. The ms(2)Z1168 mutant exhibited anomalies in nuclear lamina structure together with chromatin condensation defects. The ms(2)Z1168 genetic analysis narrowed the gene locus to a genomic region containing 12 genes. The gene identification was further refined by reverse genetic approach using RNA interference and by sequencing. Mutations affecting a regulatory region of CG7810 gene were identified in the mutant genome. Finally, since the ms(2)Z1168 mutant exhibited nuclear lamina defects, an accurate nuclear lamina characterization during wild type meiosis and spermatogenesis was performed. The study of mutant strains disrupted for some aspects of spermatogenesis process allows a broader understanding of the genetic and molecular factors involved in the regulation and in the execution of male meiosis and spermiogenesis.La spermatogenesi, il processo di produzione di gameti funzionali da cellule staminali germinali, rappresenta uno degli esempi più significativi di differenziamento cellulare. La disponibilità di mutanti che coinvolgono specifiche fasi della spermatogenesi, insieme ad un ciclo vitale breve, alla disponibilità di risorse genetiche, un genoma completamente sequenziato e la conservazione con l’uomo di geni e processi, rende la Drosophila un organismo particolarmente adatto per lo studio del processo di spermatogenesi. Lo scopo del presente progetto di ricerca di dottorato riguarda l'analisi di due ceppi mutanti di Drosophila melanogaster appartenenti ad una collezione unica di 13 mutanti recessivi maschio-sterile indotti tramite mutagenesi chimica con etilmetansulfonato (EMS), identificati tramite un largo screening di mutazioni maschio-sterile del cromosoma 2 e 3 (Wakimoto et al. , 2004). Un’analisi citologica preliminare delle mutazioni ha evidenziato un fenotipo aberrante generale che colpisce l'entrata in meiosi e la progressione del ciclo cellulare: i mutanti saltano una o entrambe le divisioni meiotiche effettuando, anche se con anomalie, il differenziamento degli spermatidi. Il ceppo mutante ms(2)Z5584 è stato precedentemente caratterizzato sia geneticamente che citologicamente. E’ stata individuata una mutazione puntiforme nel gene rae1 che determina fenotipi aberranti a carico di tutto il processo di spermatogenesi (Volpi et al., 2013). A partire da queste evidenze, ho effettuato una serie di esperimenti di interferenza dell’RNA per il gene rae1 allo scopo di confermare che la mutazione identificata a carico del suddetto gene fosse proprio quella responsabile del fenotipo mutante mostrato dal ceppo ms(2)Z5584. In secondo luogo, è stata effettuata un’ analisi di localizzazione della proteina RAE1 durante il ciclo cellulare meiotico attraverso il sistema GAL4/UAS che permette l'espressione del costrutto transgenico UASGFP-rae1 sia attraverso un driver testicolo-specifico che costitutivo. Infine, è stato effettuato un esperimento di “rescue” del fenotipo nel ceppo mutante ms(2)Z5584 al fine di verificare se il transgene UASGFP-rae1 fosse in grado di ripristinare il fenotipo selvatico nel suddetto mutante. Il secondo ceppo mutante ms(2)Z1168 è stato caratterizzato a livello citologico e genetico. L'analisi citologica è stata eseguita con la tecnica dell’ immunoistochimica e i preparati sono stati analizzati mediante microscopia confocale. Il ceppo mutante ms(2)Z1168 mostra anomalie a carico della struttura della lamina nucleare insieme a difetti di condensazione della cromatina. Inoltre, è stata effettuata una accurata caratterizzazione del comportamento lamina nucleare durante il normale processo di spermatogenesi e in meiosi. L'identificazione del gene responsabile del fenotipo mutante del ceppo ms(2)Z1168 è stata effettuata con un approccio genetico utilizzando l’interferenza dell’ RNA e con approccio molecolare tramite sequenziamento genico. Lo studio di ceppi mutanti con difetti a carico di stadi precisi del processo di spermatogenesi consente di ottenere una più ampia comprensione dei fattori genetici e molecolari coinvolti nella regolazione e nella esecuzione della meiosi maschile e spermiogenesi.Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellular

Topics: Spermatogenesis, Meiosis, RAE1, Nuclear lamina, Drosophila, Lamina nucleare, Spermatogenesi, Meiosi, BIO/18
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Year: 2014
OAI identifier: oai:http://dspace.unitus.it:2067/2823
Provided by: Unitus DSpace
Download PDF:
Sorry, we are unable to provide the full text but you may find it at the following location(s):
  • http://hdl.handle.net/2067/282... (external link)
  • Suggested articles


    To submit an update or takedown request for this paper, please submit an Update/Correction/Removal Request.