Estudo das caracteristicas bioquimicas da pululanase de Klebsiella sp e sua aplicação

Abstract

Resumo: Duas mil cento e quarenta linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de solo, frutas e flores e testadas quanto à capacidade de desramificar a amilopectina. Dez linhagens de bactérias foram selecionadas preliminarmente como produtoras de enzimas amiloífticas desramificantes. Entre estas, uma linhasem identificada como Klebsiella sp apresentou alta produtividade de pululanase. A enzima amilolítica desramificante da Klebsiella sp hidrolisou as ligações glicosídicas alfa-1,6 do amido e da pululana (polímero de maltotrioses unidas pela extremidade por ligações glicosídjcas alfa-1,6). A enzima pode ser classificada como uma pululanase (pululana 6-glucanohidrolase, E.G.3.2.1.41). Estudou-se a produção da pululanase extracelular pela linhagem selecionada de Klebsiella sp e a enzima foi purificada através de fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia em coluna de DEAE-celulose e CM-celulose. A eletroforese da enzima purificada em gel de poliacrilamida e amílopectina mostrou uma banda de atividade amilolítica desramificante. A enzima purificada foi caracterizada. A enzima apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 50ºC. A atividade enzimática não foi afetada por NaCl; KCl; LiSO4 ; Al2O3 ; Ba(OH)2 ; CaCO3 ; NiSO4 ; MgCl2 ; ZnSO4 ; MnCl2 ; CuSO4 ; Fe2(SO4)3 ; FeCl3 e CaCl2 porém foi fortemente inibida por HgCL2 na concentração 1 mM de sal em relação ao volume finai da mistura de reação. O reagente N-bromosuccinimida na concentração 0,1 mM em reiação ao volume finai da mistura de reação inibiu totalmente a atividade de pululanase, indicando que resíduos triptofano podem estar envolvidos na atividade enzimática. P-Cloromercuribenzoato e iodoacetamida não inibiram a pululanase de Klebsiella sp , indicando que grupos tiol não estão envolvidos na atividade enzimática. Verificou-se que a aplicação de amiloglicosidase e de pululanase na etapa de sacarificação de mandioca reduz o tempo de reação e aumenta o rendimento da glicose. A aplicação de puiutenass em combinação com beta-amilase aumentou o rendimento na obtenção de maltose a partir de amidoAbstract: Two thousand one hundred and forty strains of microorganisms were isolated from soil, fruit and flower samples and examined for their capacity to debranch alpha-1,6 glucosidic linkages in amylopectins. Ten strains of bacteria which produce starch debranchlng enzymes were selected. Of these, one strain, which was classified as Klebsiella sp, demonstrated the highest pullulanase activity. The starch debranching enzymes of Klebsiella sp was found to hydrolyze the alpha-1,6 glucosidic bond of starch and pullulan (a polymer of maltotriose units joined by alpha-1,6 glucosidic linkages). The enzyme can be classified as pullulanase (pullulan 6-glucanohydrolase E.G.3.2.1.41.). The production of extracelular pullulanase was performed by using the selected strain of Klebsiella sp, and the enzyme was purified by fractionation with ammonium sulfate, DEAE-cellulose and CM- cellulose column chromatography. Electrophoresis of the purified enzyme using a mixed polyacrilamide and amylopectin gel showed one band which had debranching activity. The purified enzyme was characterized. The optimum pH and temperature of the enzyme were 6 and 50ºC respectively. The enzyme activity was not affected by 1 mM NaCl; KCl; LiSO4 ; Al2O3 ; Ba(OH)2 ; CaCO3 ; NiSO4 ; MgCl2 ; ZnSO4 ; MnCl2 ; CuSO4 ; Fe2(SO4)3 ; FeCl3 and CaCl2 in the final reaction volume, but it was strongly inhibited by HgCl2 .A concentration of 0,1 mM of the reagent N-bromosuccinimide in the final reaction volume totally inhibited the pullulanase activity, indicating that tryptophan residues may be involved in the enzymatic activity. p-Chloromercuribenzoate and iodoacetamide did not inhibit pullulanase activity of Klebsiella sp , indicating that thiol groups are not involved in the enzyme activity.It was found that when a mixture of amiloglucosidase and pullulanase was used for the saccharification of cassava starch, the reaction time was reduced and the yield of glucose increased. The application of pullulanase together with beta-amylase also increased the yield of maltose derived from starc