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Recuperação e isolamento de enzimas por participação de bioafinidade em sistemas de duas fases aquosas

By Maria Estela da Silva

Abstract

Resumo: Este trabalho visou estudar o emprego de ligantes de afinidade para extração e purificação de diferentes enzimas por partição em sistemas de duas fases aquosas (SDF A). O emprego de ligantes específicos em um estágio inicial de um processo extrativo visa reduzir o número de etapas do mesmo, pois ao aumentar a seletividade e especificidade de uma operação, as próximas são diretamente beneficiadas pela redução de carga do material contaminante. Inicialmente foram investigados métodos de ativação química do polietilenoglicol (PEG) com o intuito de torná-lo mais reativo para o acoplamento da molécula do ligante. Foram usados dois métodos de ativação deste polímero: com cloreto de tresila e com cloreto de tionila. Para ativação com cloreto de tresila, o rendimento obtido foi de 74%, determinado pela análise do enxofre elementar, enquanto que para a ativação com cloreto de tionila, o rendimento obtido foi de 86% (p/p) (capítulo 7). Um estudo para extração e recuperação da f3-galactosidase de diferentes origens microbianas: Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae e Escherichia co/i foi então realizado (capítulo 3) e foi observado que somente a 13¬galactosidase de Escherichia coli era coletada na fase superior em sistema formado por PEG 4000 15% e fosfato 13,6% (coeficiente de partição, K = 52). As demais 13¬galactosidases eram sempre particionadas em direção à fase inferior salina juntamente com as principais proteínas contaminantes, impossibilitando a separação e purificação. Com o objetivo de separar a f3-galactosidase das outras proteínas, um processo específico de partição por afinidade foi desenvolvido, o qual consistiu de duas etapas: acoplamento específico da enzima ao ligante e rompimento desta interação. Para eficiente separação entre a f3-galactosidase de Kluyveromyces fragilis e os contaminantes protéicos foi desenvolvido um processo em duas etapas, aonde a primeira utiliza o ligante APGP (p¬aminofenil-f3-D-tiogalactopiranosídeo). Os sistemas usados foram formados, na primeira etapa (acoplamento da enzima), por PEG 4000-APGP 6% e dextrana 505.000 8% e na segunda etapa (desacoplamento da enzima) por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. Na primeira etapa de purificação, o K da β-galactosidase teve um aumento de aproximadamente 2.800 vezes com o uso do PEG-APGP, apresentando recuperação de 55% da enzima na fase polimérica do sistema PEG-APGP/dextrana e a segunda etapa da purificação da enzima foi realizada em sistema formado por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. mostrando-se altamente eficiente na reversão do K da enzima β-galactosidase para a fase oposta. O valor do coeficiente de partição foi de 2,2 x 10-5 com 39% de recuperação da enzima na fase salina (capítulos 3 e 4). Com o intuito de investigar a capacidade do polímero de afinidade PEG-IDA-CU2+ em extrair proteínas nos SDF A, a partição da lisozima proveniente de clara de ovo e da peroxidase de soja foi investigada (capítulos 5 e 6). A lisozima de clara de ovo de galinha foi utilizada como enzima modelo nos estudos preliminares em sistemas de afinidade contendo o complexo PEG-IDA-Cu2+. Esta enzima possui um resíduo de histidina disponível na sua superfície, tornando viável sua extração neste tipo de sistema, já que um resíduo de histidina é suficiente para formar o complexo enzima-metalo-ligante. As concentrações empregadas foram de PEG 4000 13% e fosfato de potássio 9% (p/p), pH 7,0 nos SDF A sem o ligante. Em sistemas de afinidade, as concentrações do PEG-IDA-Cu2+ foram de 1, 5 e 10% e as concentrações de PEG 4000 foram de 12, 8 e 3%, respectivamente, sendo que a concentração do fosfato permaneceu em 9%. O valor do coeficiente de partição, K, foi aumentado 9 vezes quando PEG-IDA-Cu2+ foi usado nos SDF A de afinidade, sendo possível recuperar 51 % da lisozima. Para recuperação da peroxidase de soja, Glycine max, o metalo-ligante cobre (Cu2l foi acoplado ao complexo PEG-IDA, formador da fase polimérica do sistema. Duas etapas foram suficientes para a recuperação da peroxidase usando sistemas de afinidade. Na primeira etapa da extração, o sistema foi composto por PEG-IDA-CU2+ 14% e sulfato de sódio 8% para o acoplamento da enzima e na segunda etapa, um sistema constituído de PEG-IDA-CU2+ 14% e fosfato 10% foi usado para o desacoplamento da enzima, a qual foi recuperada na fase salina. Obteve-se um aumento de K de 24 vezes e recuperação maior que 109% da enzima, quando o sistema de afinidade foi usado. Na etapa de desacoplamento da enzima obteve-se 64% de recuperação. A fase polimérica foi recic1ada e usada num sistema contendo PEG-IDA-Cu2+ 14% e sulfato de sódio 8%, obtendo-se um K = 23, com recuperação de 85% da peroxidaseAbstract: In this work the extraction and purification of f3-galactosidase from different species and soybean peroxidase (Glycine max) in aqueous two-phase systems (ATPS) by bioaffinity were studied. The synthesis of affinity polymers to recover this enzyme was also studied. Initially the extraction of f3-galactosidase from Kluyveromyces Iactis, from Kluyveromyces fragi/is, from Aspergillus oryzae and from Escherichia co/i was compared. It was observed that only the f3-galactosidase from Escherichia colí partitioned to the top phase in. a system formed of 15% PEG 4000 and 13.6% phosphate (partition coefficient, K = 52). f3-galactosidases from other sources partition into the bottom salt-rich phase, together with the main contaminant proteins, preventing separation and purification. The specific ligand APGP (p-aminophenyl 1-thio-f3-D-galactopyranoside) is an inhibitor of f3-galactosidase, and it was attached to polyethylene glycol (pEG). Two methods of activation were used: activation with tresyl chloride and with tionyl chloride. The yield for activation of tresyl chloride was 74%, determined by elementary sulphur analysis, and the yield for activation with tionyl chloride was 86%. A new two-step method for extraction and purification of the enzyme f3-galactosidase from Kluyveromyces fragilís was then developed. In the first step, an affinity system composed of 6% PEG 4000-APGP and 8% dextran 505 was used, where f3-galactosidase primarily partitioned toward the top phase (K 2,330). In the second step, a system formed of 13% PEG-APGP and 9% phosphate salt was used to revert the value of the partition coefficient, K, of f3-galactosidase to 2 x 10-5, thereby achieving the purification and recovery of39% of the enzyme in the bottom salt-rich phase. The extraction of the model protein lysozyme from chicken egg white was studied by affinity in systems with the complex PEG-IDA-CU2+. This enzyme has a histidine residue available on its surface, making possible its recovery in this system. Metal affinity partitioning in ATPS is a useful tool to extract the proteins which have accessible histidine, cysteine or tryptophan on their surfaces. Partitioning of lysozyme in a PEG 4000/phosphate system, pH 7.0, was studied in the presence and in the absence of PEG-IDA-CU2+. The composition of systems without ligands was 13% PEG 4000 + 9% phosphate, and the affinity systems had correspondent amounts of PEG 4000 replaced by 1%, 5% and 10% of PEG-IDA-CU2+. The partition coefficient, K, of the lysozyme increased ninefold when 5% PEG-IDA-CU2+ was used, and 45% of the enzyme was recovered in the top ligand-rich phase of the system. This is a pioneer work on liquid-liquid extraction of lysozyme in ATPS with PEG-IDA-CU2+. Then the extraction of peroxidase from a crude extract of defatted soybean peroxidase (Glycine max) by metal affinity in an ATPS was studied. A two-step liquid¬ liquid extraction process using metalligand was developed aiming to purify the peroxidase. In the first purification step, the system was composed of 14% PEG 4000-IDA-CU2+ and 8% Na2S04and the peroxidase partitioned mainly to the top phase (K = 24). In the second step, a system formed of 14% PEG 4000 and 10% phosphate was used to revert the value of the partition coefficient of peroxidase to the bottom salt-rich phase (K = 0.05), providing the purification and recovery of 64% of the enzyme. The top PEG 4000-IDA-CU2+ -rich phase was washed by ultrafiltration in order to remove the sulphate salt and reused in another cycle of peroxidase purification. Only two steps were enough to recover the enzymes f3-galactosidase and peroxidase in the ATPS by bioaffinit

Topics: Beta-galactosidase, Peroxidase, Lisozima
Year: 2014
OAI identifier: oai:agregador.ibict.br.RI_UNICAMP:oai:unicamp.sibi.usp.br:SBURI/4604
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