Analysis of the effect of aminiotic fluid on uNK cells in the mice pseudopregnant uterus

Abstract

As células Natural Killer uterinas (uNK) participam da interação materno fetal atuando ativamente como elemento imuno-modulador do micro-ambiente uterino na gestação bem sucedida. Apesar das uNK possuírem um potencial lítico, relacionado com a sua resposta imune inata, este não se manifesta em uma gestação normal. Por outro lado, diversos relatos sugerem o envolvimento destas células em abortos e interrupções da gestação. No presente trabalho, foi avaliado o possível envolvimento das células uNK em atividade citotóxica sob a influência "in loco" do líquido amniótico no útero pseudogestante de camundongos. Para tanto, camundongos fêmeas foram acasaladas com machos vasectomizados, e os cornos uterinos injetados com óleo mineral para indução do útero pseudogestante. O líquido aminótico coletado em condições assépticas dos sítios de desenvolvimento embrionário normal no 10° dia de gestação (dg), foi inoculado no volume constante de 3uL através de micro-injeção na parede uterina da região antímesometrial nosnódulos de decidualização dos animais no 9o dia de pseudogestação (dpg). Amostras dos sítios inoculados com líquido amniótico foram coletadas nos intervalos de 30 minutos, 1, 2 e 6 horas para análises morfológicas, citoquímicas, imunocitoquímicas, imunoquímica e expressões gênicas. Como controles, foram utilizados úteros gestantes normais no 8o dg e úteros pseudogestantes submetidos à introdução de agulha hipodérmica na parede do corno uterino e/ou inoculados com 3uL de solução fisiológica estéril.Pelas análises morfológicas realizadas em cortes histológicos avaliados pela coloração de hematoxilina-eosina, o endométrio decidualizado da região mesometrial e antímesometrial do útero pseudogestante inoculado com salina ou simples introdução da agulha hipodérmica não apresentaram variações. Igualmente, a morfologia das células uNK através da citoquímica com lectina DBA, não apresentou diferenças entre os grupos controles. Ainoculação de LA no útero pseudogestante promoveuhiperemia local após 30 minutos que, em cortes histológicos, foi constatada como estagnação do sangue e dilatação dos vasos venosos no endométrio. Nestes locais foram constatadas alterações degenerativas nas células uNK com perda de reatividade da superfície celular e no conteúdo dos grânulos através da lectina DBA. A análise immunocitoquímica, RT-PCR e ELISA para as citocinas IFN-y e TNF-a e, das proteínas perforina e granzima-A revelaram que, o líquido amniótico acentuava a expressão destas moléculas ou dos seus genes relacionados à resposta pró-inflamatória, enquanto não alteravam a expressão de moléculas anti-inflamatórias como a IL-10. A geração do óxido nítrico (NO), através da quantificação de nitrato e nitrito, demonstrou um aumento nas concentrações, principalmente do nitrito após a inoculação do líquido amniótico. O teste de TÚNEL e a imunocitoquímica para anti-caspase-3 revelaram aumento de marcações positivas nas células uNK e deciduais sob o efeito do líquido amniótico em relação aos grupo controles, enquanto se verificava uma relação inversa para a imunocitoquímica com o anti-PCNA aos 2 a 6 horas após líquido amniótico. O conjunto dos resultados obtidos comprovam que as células uNK são sensíveis à ação local do líquido amniótico, com padrão de resposta compatível à ativação da sua capacidade citotóxica e pró-inflamatória relacionada com a resposta imune inata.Uterine Natural Killer (uNK) cells participate on the maternal fetus interaction actively playing as a immunomodulator element of the uterine micro-enviroment during a well successful gestation. Despite uNK having a lytic potencial that is related to its innate immune responsive, this does not manifest in a normal gestation. Moreover, several reports suggest the involvement of these cells in abortions and interruptions of gestation. In this study, we investigated the possible involvement of uNK cells in cytotoxic activity under the influence "in loco" of amniotic fluid in the uterus of mice pseudopregnant. For this, female mice were mated with vasectomized males and the uterine horns injected with mineral oil for induction of the pseudopregnant uterus. The amniotic fluid collected aseptically from sites of normal embryonic development in the 10 th day of gestation (dg) was inoculated on the constant volume of 3ul_ through microinjection on the uterine wall in the antimesometrial region into uterine nodules from animals on the 9th day of pseudopregnancy (dpg). Samples of inoculated sites with amniotic fluid were collected at intervals of 30 minutes, 1, 2 and 6 hours for morphological, cytochemical, immunocytochemical, immunochemical and relative gene expressions analyses. As controls, normal pregnant uteri on the 8th dg, and uterus on 9th dpg were submitted to the introduction of a hypodermic needle into the wall of the uterus and/or inoculated with 3uL of sterile saline.For the morphological analysis performed on histological sections evaluated by hematoxylin-eosin, the decidualized endometrium of the mesometrial and antimesometrial regions of the pseudopregnant uterus were inoculated with saline or simple introduction of the hypodermic needle showed no variations. Also, the morphology of uNK cells by DBA lectin cytochemistry, evidenced no differences among control groups.The amniotic fluid inoculation on the pseudopregnant uterus promote Hyperaemia after 30 min, in histological slides that was observed as blood interruption flow and dilatation of the vessels on the endometrium. On these areas it was observed degenerative modifications on uNK cells with loss in the positive reaction to DBA lectin in the cellular membranes and in the granules.The immunocytochemical analysis, RT-PCR and ELISA for the cytokines IFN-y and TNF-a, and the perforin and granzyme-A protein revealed that the amniotic fluid enhanced the expression of these molecules or their genes related to pro-inflammatory response, while not altering the expression of anti-inflammatory molecules such as IL-10.The generation of nitric oxide (NO), was observed through the quantification of nitrate and nitrite that demonstrated an increase in concentrations, primarily of nitrite after inoculation of amniotic fluid.The TUNEL assay and immunocytochemistry for anti-caspase-3 revealed an increase on positive uNK and decidual cells under the effect of amniotic fluid in relation to the control group, while there was an inverse relationship to immunocytochemistry with anti-PCNA at 2 and 6 hours after the amniotic fluid. The overall results show that uNK cells are sensitive to local action of amniotic fluid, compatible with standard response to the activation of their cytotoxic and proinflammatory that are related to the innate immune response