Enzimas que lisam a parede celular de leveduras : clonagem e sequenciamento do gene da [beta]-1,3-glucanase litica de Cellulomonas cartae 191

Abstract

A linhagem 191, isolada previamente no laboratório de Bioquímica da FEA-UNICAMP e identificada como Cellulomonas cartae, é uma boa produtora da enzima 'beta' 1,3-glucanase envolvida na lise da parede celular de levedura. O objetivo deste trabalho foi o estudo da 'beta'-1,3-glucanase lítica produzida pela linhagem C. cartae 191; sua produção em meio de cultura, purificação e a clonagem molecular do gene que codifica essa enzima. A linhagem 191 foi crescida em meio contendo diferentes indutores e as condições de cultivo foram otimizadas através de planejamento experimental para o aumento da produção dessa enzima. A 'beta'-1,3-glucanase lítica foi purificada do sobrenadante do meio de cultura através de ultrafiltração (membrana de exclusão de 10 kDa), cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose equilibrada em tampão acetato de sódio O,OIM, pH 5,5 e eletroforese em SDS-PAGE. A região N-terminal dessa proteína foi seqüenciada e o gene da 'beta'-1,3-glucanase foi isolado do genoma de C. cartae 191. O gene que codifica essa enzima foi seqüenciado e clonado em células de Escherichia coli DH5a ...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digitalThe strain Cellulomonas cartae 191, which was previously isolated by the Biochemistry laboratory at FEA-UNICAMP, shows a good 'beta' -1,3-glucanase production. The 'beta'-1,3-glucanase enzyme has an important role in yeast celllysis. The aim ofthis work was to study the lytic 'beta'-1,3-glucanase from C. cartae 191; its production, purification and molecular cloning of this gene. The strain 191 was grown on a medium containing different carbon sources and the 'beta'-1,3-glucanase production was studied by experimental design. The lytic enzyme was purified from the crude supematant by ultrafiltration (10 kDa cut off membrane), ion exchange chromatography with a DEAE-Sepharose column, equilibrated in 0.01 M sodium acetate buffer at pH 5.5 and SDS-PAGE electrophoresis. The N-terminal sequence ofthe lytic enzyme was obtained and the 'beta'-1,3-glucanase gene was isolated from C. cartae 191 genome and subsequently cloned in Escherichia coli DH5a cells ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations