Preparação de um arranjo experimental para a eletroporação de célula única

Abstract

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica, Florianópolis, 2013.Este trabalho objetiva a preparação de um arranjo experimental para o estudo da eletroporação de célula única. Quando a membrana celular é submetida a um campo elétrico externo suficientemente intenso, poros de escala nanométrica se formam na membrana, aumentando sua permeabilidade. Esse fenômeno é chamado de eletroporação. Apesar da eletroporação ser usada em uma série de processos, a dinâmica da abertura e crescimento dos poros ainda não é totalmente conhecida, e não há um modelo matemático confiável que permita a simulação quantitativa do fenômeno. Experimentos da eletroporação podem ser feitos em células em suspensão (tradicional), aplicando-se campos elétricos com eletrodos de placas paralelas, ou em células únicas, com o auxílio de eletrodos capilares repletos com eletrólito (EFC). A última opção possui a vantagem de permitir a obtenção de dados mais consistentes para a modelagem do fenômeno, uma vez que as medições são referentes aos efeitos em uma única célula e não uma combinação dos eventos que ocorrem nas diversas células (de tamanhos diferentes). Além disso, possibilita a eletroporação de células ou regiões específicas de tecidos in vivo. Neste trabalho, um modelo matemático foi adaptado para arranjos experimentais de eletroporação de célula única com EFCs. O modelo adaptado permitiu a avaliação qualitativa do número de poros criados e suas dimensões em diferentes regiões da membrana celular. Quanto maior a intensidade do estímulo elétrico, maior é o número de poros, e menor é o raio destes poros. O aprimoramento do modelo depende da obtenção de dados experimentais. Também foi preparado um arranjo experimental físico para a realização de experimentos de eletroporação de célula única com eletrodos do tipo EFC, que inclui o desenvolvimento de um nanoamperímetro. O conjunto permitiu: a caracterização da impedância dos eletrodos EFC produzidos no laboratório como praticamente resistivos de 0 a 10kHz; e a identificação do posicionamento do eletrodo em relação à membrana ou tecido a partir de medições de variações da impedância. Aproximando-se de uma célula única, o eletrodo atinge o posicionamento adequado com um deslocamento de alguns micrômetros, enquanto quando o alvo é um tecido muscular, o deslocamento é de algumas centenas de micrômetros. Estes resultados indicam que com este arranjo experimental, será possível a eletroporação de células e tecidos em cultura, e assim, permitir a obtenção de dados relativos ao número e às dimensões dos poros formados <br>This work aims to develop an experimental set-up for the study of singlecell electroporation. Whenever cell membrane is submitted to a sufficiently intense electric field, nanoscale pores are formed, increasing membrane permeability. The phenomena is termed electroporation. In spite of being used in several processes, dynamics of pore creation and development is not yet known, and there is no trustful mathematical model that allows quantitative numerical simulations of electroporation. Electroporation experiments may be traditionally performed in cell suspensions (bulk electroporation), by applying electric fields through parallel plates, or in a single-cell set-up, with electrophysiology capillary electrodes (EFC). The latter set-up has the advantage to provide more consistent data to feed mathematical model development, once the measurements relate to the effects on a single-cell, while the results obtained by bulk electroporation are a combination of the effects of the events occurred on several cells of different size. Besides, it allows the electroporation of specific cells or tissue regions textitin vivo. In this work, a mathematical model was adapted to single-cell electroporation set-ups with an EFC. The model enabled qualitative analysis of pore creation and dimensions in different regions of cell membrane. The greater the intensity of the electrical stimulus, the greater the number of pores created, and smaller are the radii of the pores. Upgrading the model depends on the collection of experimental data. An experimental set-up was prepared for single-cell electroporation with EFC type electrodes, which include the development of a nanoampere ammeter. This set-up permited: the characterization of the impedance of EFC electrodes made in the laboratory as practically resistive from 0 to 10kHz; the identification of the position of the electrode tip with respect to the cell membrane or tissue through impedance variations measurements. When approaching a single cell, the electrode reaches the appropriated proximity within a displacement of a few unities of micrometer, while when the target is muscular tissue, the displacement is of some hundreds of micrometers. These results indicate that, with this experimental set-up, it will be possible to electroporate cells grown in cultures and tissues, and thus to provide the gathering of information related to pore creation and pore dimensions. Keywords: Electroporation. Electropermeabilization. SCEP. Mathematical Models. Cell Membrane