Envolvimento de receptores da resposta imune inata e dos inflamassomos na biogênese e função dos corpúsculos lipídicos durante infecção por Mycobacterium bovis BCG

Abstract

Corpúsculos lipídicos (CLs) são organelas citoplasmáticas altamente associadas à resposta inflamatória. Eles estão presentes em diversos tipos celulares e podem aumentar em número e/ou tamanho frente à situações infecciosas. Também altamente envolvidos com os fenômenos inflamatórios estão os inflamassomos. Classicamente, esses complexos moleculares são formados por um tipo de receptor tipo Nod (NLR), uma proteína adaptadora (geralmente ASC) e a enzima caspase-1 ativada. A reunião destas proteínas e a ativação de caspase-1 levam à clivagem das pro-formas de IL-1\03B2 e de IL-18 em suas formas maduras prontas para liberação. Apesar do avanço no conhecimento da biologia destas duas estruturas, corpúsculos lipídicos e inflamassomos, nada foi descrito sobre uma possível interação entre elas. Utilizando um modelo de estudo em macrófagos derivados de medula óssea de camundongos C57Bl/6 e infecção com Mycobacterium bovis BCG buscamos pesquisar se existe essa interação e de que maneira isso ocorreria. Num primeiro momento, pesquisamos a influência de receptores tipo nod e proteínas relacionadas, na biogêsene de CLs, na liberação de IL-1\03B2 e de eicosanóides. Observamos que a infecção dos macrófagos com BCG é capaz de induzir liberação de IL-1\03B2 e ativação de caspase-1, caracterizando ativação de inflamassomos. Vimos que a ausência de Nod1, Nod2, Rip2, IL-1R1 e IL-18R não interfere na biogênese de CL, nem na liberação de IL-1\03B2 e de PGE2 e LTB4. A ausência de ASC, caspase-1 e o bloqueio de NLRP3 e P2X7 potencializam a formação de corpúsculos lipídicos induzida por BCG A ausência de ASC e caspase-1 não altera a liberação de eicosanóides e o bloqueio de NLRP3 reduz a liberação de IL-1\03B2 e de PGE2. Vimos que ATP é capaz de induzir a biogênese de corpúsculos lipídicos de maneira dependente de P2X7. Concluimos que a presença de proteínas envolvidas na via dos inflamassomos regula negativamente a biogênese de corpúsculo lipídicos. Corpúsculos lipídicos são conhecidos por compartimentalizar diversas proteínas envolvidas em importantes fenômenos celulares, dependendo do tipo celular e do estímulo. Sendo assim, no segundo bloco, avaliamos se os corpúsculos gerados pela infecção com BCG seriam capazes de armazenar NLRs e proteínas associadas. Também avaliamos se a inibição da formação de corpúsculos lipídicos teria impacto sobre a ativação de inflamassomos e liberação de mediadores inflamatórios. Observamos a presença de NLRP3, caspase-1, IL-1\03B2, Nod1, Nod2 e Rip2, mas não de ASC, nos corpúsculos lipídicos. Também vimos que a redução da formação de CL induzida por BCG leva à redução da liberação e da síntese de IL-1\03B2, mas não interfere na atividade de caspase-1. Diminui também a liberação de citocinas pro e anti-inflamatórias, além de PGE2. Baseado em nossos resultados, concluimos que existe sim uma relação entre CLs e inflamassomos, onde o segundo pode regular negativamente o primeiro e CLs podem servir de plataforma, pelo menos transitória, para a localização de proteínas da via dos NLRs. O avanço no entendimento das funções de inflamassomos e corpúsculos lipídicos pode colaborar para a geração de estratégias de combate às patologias associadas à estas duas estruturasPathogen - triggered dysregulation of host - cell lipid metabolism is emerging as a key feature in the pathogenesis of mycobacterial infection. Accumulating evidence suggests that modulation of host lipid metabolism through mycobacteria - induced lipid body (LB) formation is an important mechanism for mycobacterial survival and growth. However the mechanisms involved in lipid body biogenesis are still not completely understood. Mycobacterial - induced inflammasome activation of caspase - 1 and consequent secretion of IL - 1β and IL - 18 in macrophages has been demonstrated as a host - defense mechanism. In the present study we investigated the participation of inflammasomes in lipid body biogenesis and function during infection with Mycobacterium bovis BCG in macrophages. W e observed IL - 1 β release and caspase - 1 activation in bone marrow macrophage, featuring inflammasome activation induced by BCG. Nod1, Nod2, Rip2, IL - 1R1 and IL - 18R doesn't influence lipid bodies biogenesis, neither IL - 1 β nor PGE 2 and LTB 4 release induced by BCG . ASC and caspase - 1 absence and the block of NLRP3 and P2X 7 leads to increase lipid bodies number induced by BCG . The absence of caspase - 1 and ASC inhibited the release of IL - 1β induced by BCG , but does not alter the release of eicosanoids. Blocking NLRP3 reduces the release of both, IL - 1β and PGE 2 . Using an activator of inflam ma somes , ATP, we observed an indu ce d lipid body biogenesis in a P2X 7 - depende nt manner . Activation of inflam m asome s by L PS and ATP leads to increased release of eicosanoids, besides the formati on of LB s. W e conclude that the presence of proteins involved in the pathway of inflamassom e s negatively regulate s biogenesis of lipid bodies. Lipid bodies are known to compartmentalize many different proteins associated with cell signaling , depending on t he cell type and stimulus. Thus , in the second block , we assessed whether the LBs generated by infection with BCG would be able to contain NLR s and associated proteins. We also evaluated whether the inhibition of lipid body for mation would impact inflam m asome s activation and re lease of inflammatory mediators. We observed NLRP3, caspase - 1 , IL - 1β, Nod1, Nod2 and RIP2 , but not ASC are associated wi th lipid bodies. Also , we have that the reduction in the formation of LC induced by BCG leads to reduced synthesis and release of IL - 1β but did not interf ere in the activity of caspase - 1. It also reduces the release of cytokines , in addition to PGE 2 . Base d o n our results , we conclude that inflam m asome s activation could negatively regulate the lipid bodies biogenesis . Moreover, lipid bodies could be site of localization to NLRs and associated - protein , but they doesn't interfere in inflammasomes activation, although the IL - 1β release is reduced by lipid bobies numbers decreased. The knowledge of inflammasome and lipid bodies biology could be useful to generate new approaches to diseases associated with these structure