Analysis of β-Xylosidase II expression of the aquatic bacterium Caulobacter crescentus and its role in the utilization of agro-industrial residues

Abstract

Materiais lignocelulÃsicos sÃo abundantes em resÃduos agroindustriais e subprodutos da agroindÃstria e podem ser usados para produÃÃo de combustÃveis e outros quÃmicos de interesse comercial. Uma alternativa aos mÃtodos fÃsicos e quÃmicos para bioconversÃo de material lignocelulÃsico à o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactÃria aquÃtica Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnolÃgico para o uso destes resÃduos por conter em seu genoma vÃrios genes que codificam para enzimas envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulÃsicos, incluindo 5 genes para β- Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a β-xilosidade II de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura nos sÃtios EcoRI/XbaI do vetor de expressÃo pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteÃna de fusÃo com cauda de histidinas foi obtida apÃs induÃÃo da expressÃo do gene xynB2 em E. coli (DH10B) com IPTG (1mM). A β-xilosidade II recombinante (β-Xil-II-rec) foi purificada por cromatografia usando resina de nÃquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a parÃmetros cinÃticos e bioquÃmicos. Uma banda Ãnica de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE 9% para a β-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade especÃfica de 215 U/mg, pH Ãtimo igual a 6, temperatura Ãtima de 55ÂC e meia vida de 4 horas a 50ÂC. ApÃs 24 h de incubaÃÃo em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A maioria dos Ãons inibiu a atividade de β-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado na presenÃa de KCl (2mM). Os parÃmetros cinÃticos KM e VMÃx foram iguais a 8,4 mM e 370 moles/min, respectivamente. A capacidade da β-Xilosidase II recombinante pura de C. crescentus hidrolisar xilano e o resÃduo bagaÃo de cana foi avaliada apÃs incubaÃÃo prÃvia destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de produtos de hidrÃlise do xilano e bagaÃo de cana-de-aÃÃcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes, respectivamente, apÃs incubaÃÃo por 18 horas com a β-Xil-II-rec pura de C. crescentus, ressaltando assim, a possibilidade de aplicaÃÃo desta enzima em processos biotecnolÃgicos. Em adiÃÃo, a β-Xil-II-rec foi usada para a produÃÃo de um anticorpo policlonal em coelho que mostrou por ensaios de âWestern Blotâ uma elevada especificidade para reconhecimento da proteÃna purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi construÃdo pela inserÃÃo de um cassete de resistÃncia a espectinomicina dentro do gene xynB2 por dupla recombinaÃÃo homÃloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor indutÃvel por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de β-Xilosidase foi mensurada nas cÃlulas das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C. crescentus, as quais cresceram na ausÃncia e presenÃa de diferentes resÃduos agroindustriais. A depleÃÃo do gene xynB2 fez as cÃlulas mais hÃbeis a produzirem altas atividades de outras β-Xilosidases na presenÃa de diferentes resÃduos ou fontes de carbono. Estes resultados indicam que a ausÃncia do gene xynB2 regula positivamente a expressÃo de outras β-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decrÃscimo na atividade de β- Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressÃo da β- XilosidaseII regula negativamente a atividade de β-Xilosidases. Para verificar se a variaÃÃo nos nÃveis de atividade de β-Xilosidase ocorre como um reflexo de variaÃÃes nos nÃveis de transcriÃÃo de genes de β-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construÃdo uma fusÃo de transcriÃÃo a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E. coli. Assim, foi quantificada a atividade de β-Galactosidase como uma medida da atividade do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 à dependente de transcriÃÃo.Lignocellulosic materials are abundant in agro-industrial residues and by-products of agroindustry and can be used for fuels and other chemicals of commercial interest. An alternative to physical and chemical methods for bioconversion of lignocellulosic material is the use of enzymes produced by micro-organisms. The aquatic bacterium Gram negative Caulobacter crescentus presents biotechnological potential for the use of these residues because it contains in its genome several gene coding for enzymes involved in the metabolism of lignocellulosic materials, including 5 genes to β-Xylosidases. In this study, the gene xynB2 (1.5 kb) coding the C. crescentus β-Xylosidase II was cloned into the vector pJet1.2 (Fermentas) and subcloned in frame in the sites EcoRI/XbaI of expression vector pPROEXHta (Invitrogen). A histidine tail fusion protein was obtained after induction and expression of gene xynB2 in E. coli (DH10B) with IPTG (1 mM). The recombinant β-Xylosidase II (β-Xylrec- II) was purified by chromatography using nickel-Sepharose resin and a pure enzyme was characterized by biochemical kinetics parameters. A single band of 65 kDa was obtained by SDS-PAGE 9% for C. crescentus β-Xyl-rec-II purified, which showed a specific activity of 215 U / mg, pH optimum equal to 6, the optimum temperature of 55 ÂC and half life of 4 h at 50 ÂC. After 24 h incubation at pH 6 the enzyme retained 95% of activity. Most of the ions inhibited the activity of β-Xylosidase II, but a 32% increase was observed in the presence of KCl (2mM). The kinetic parameters KM and VMÃx were equal to 8.4 mM and 370 moles / min, respectively. The ability of C. crescentus β-Xyl-rec-II hydrolyse xylan and sugarcane bagasse residue was assessed after incubation with these Xylanase purified from Aspergillus alliaceus. The relative percentage of hydrolysis products of xylan and sugar cane bagasse, increased 2.5 and 6.5 times, respectively, after incubation for 18 hours with C. crescentus β- Xyl-rec-II pure, thus highlighting the possibility of using this enzyme in biotechnological processes. In addition, β-Xil-rec-II was also used for the production of a polyclonal antibody in rabbit that showed by "Western blot" assay a highly specific recognition of the purified protein. In order to investigate the role of xynB2 gene to C. crescentus, two mutants were obtained. The first one was constructed by insertion of a spectinomycin resistance cassette into the xynB2 gene by double homologous recombination, generating a null mutant strain named RSJU-2. The second one was obtained by cloning of xynB2 gene under the control of the inducible xylose promoter generating a strain denominated pMOA. β-Xylosidase activity was measured in the RSJU-2, pMOA and parental strain (NA1000) cells of C. crescentus which were grown in the absence and in the presence of different agro-industrial residues and others carbon sources. The xynB2 gene depletion made cells more able to produce high activities of other β-Xylosidases in the presence of different residues, for instance, β- Xylosidase activity produced by RSJU-2 cells was almost 15 times higher than the activity showed by NA1000 in the presence of sugarcane bagasse. These results indicate that the absence o xynB2 gene up-regulates the expression of other β-Xylosidases in C. crescentus. On the other hand, a decreased activity of β-Xylosidase was observed in the strain pMOA, suggesting that the overexpression of β-Xylosidase II down-regulates C. crescentus β - Xylosidases activities. To verify that the variation in activity levels of β -Xylosidase occur as a consequence of variations in the levels of transcription of β-Xylosidases genes in different strains, we constructed a lacZ- fusion transcription by cloning the E. coli lacZ gene under the control of xynB2 gene promoter. Thus, the β-Galactosidase activity was measured as a function of xynB2 promoter activity. Tests of promoter activity by measuring the activity of β- Galactosidase in different strains showed that the xynB2 gene is transcription-dependent