Avaliação da viabilidade da aplicação de técnicas biomoleculares na autenticação de produtos alimentares

Abstract

Mestrado em Biologia Molecular e CelularA carne continua a ser a fonte proteica mais comum no quotidiano das pessoas. Além disso, os produtos cárneos processados apresentam-se como uma mais-valia nas suas vidas agitadas. Este tipo de produto torna difícil a diferenciação das carnes utilizadas na sua confecção, sendo por isso propícios a adulteração. A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) tem ganho cada vez mais importância nos laboratórios de biologia molecular, revelando-se uma técnica de análise rápida, sensível e altamente específica na identificação de espécies em produtos alimentares. No entanto, vários factores podem interferir com o processo de amplificação, pelo que alguns cuidados devem ser implementados desde a aquisição da amostra a analisar, ao seu acondicionamento e posterior extração de ADN. Existem inúmeros protocolos de extração de ADN, devendo para cada estudo avaliar-se e optar-se pelo mais adequado, considerando a finalidade estabelecida para a amostra extraída. O trabalho laboratorial apresentado nesta dissertação baseou-se em três etapas principais. Inicialmente, avaliaram-se diferentes protocolos de extração de ADN, utilizando-se amostras de carne adquiridas num talho. Entre os protocolos testados, o método de Brometo de Cetil-Trimetil-Amónio (CTAB) modificado foi o que permitiu obter amostras de ADN com maior concentração e elevado nível de pureza. Posteriormente, foram testados e optimizados diferentes protocolos de amplificação, por PCR em tempo real, para a detecção das espécies Bos taurus (vaca), Sus scrofa (porco), Equus caballus (cavalo) e Ovis aries (ovelha). Foram empregues primers específicos de espécie para a detecção de genes mitocondriais e genómicos, consoante cada protocolo. Para o caso concreto do porco, foi efectuada a avaliação de dois protocolos, singleplex com EvaGreen® e tetraplex com AllHorse, para possível aplicação dos mesmos na sua quantificação. Os resultados demonstraram elevada especificidade e sensibilidade das reacções para esta espécie, permitindo a sua detecção até um limite de 0,001 ng e 0,1%, respectivamente. Somente a primeira metodologia se mostrou adequada para quantificação. Por último, as metodologias sugeridas foram aplicadas com sucesso na análise de 4 amostras comerciais de hambúrgueres, tendo-se verificado a consistência da rotulagem em todos os casos, no que concerne a composição em termos de espécies animais. O interesse de trabalhos neste âmbito recai na importância da autenticidade dos rótulos de produtos alimentares, principalmente nos produtos cárneos, para segurança dos consumidores e salvaguarda dos produtores.Meat remains the most common protein source in people’s everyday lives. In addition, processed meat products represent an asset in their hectic state of living. In this type of product it is difficult to identify the different meat species used in its manufacture and therefore they are prone to food fraud. Polymerase Chain Reaction (PCR) has gained increasing importance in molecular biology laboratories, revealing it´s suitability for rapid, sensitive and highly specific analysis of species identification in food products. However, several factors can interfere with the amplification process. Hence some precaution procedures must be implemented since the acquisition of the test sample, to its conditioning and subsequent DNA extraction process. There are numerous DNA extraction protocols and for each study a number of methods shall be evaluated so the most appropriate will be selected, considering the subsequent purpose of the extracted DNA sample. The laboratory work presented in this thesis was based on three main steps. Initially, different DNA extraction protocols were evaluated. The modified Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) method showed the best results considering DNA yield and purity. Subsequently, several amplification protocols were tested and optimized, for real time PCR detection of Bos taurus (beef), Sus scrofa (pork), Equus caballus (horse) and Ovis aries (sheep) species. Species specific primers were used for detection of mitochondrial and genomic genes, according to each protocol. In the particular case of Sus scrofa species, two protocols were tested for their quantification accuracy, a singleplex based on EvaGreen® detection and a tetraplex based on AllHorse amplification kit. The results demonstrated high specificity and sensitivity for both reactions, allowing a LOD of 0.001 ng and 0.1%, respectively. Only the first of the two tested methodologies proved to be accurate for DNA quantification. Finally, the suggested methods were successfully applied to the analysis of four hamburgers commercial samples. All checked for the consistency of labeling regarding animal species composition. The interest of this work in this area lies in the importance of authenticity of food labels, especially in meat products, for consumer safety and producers protection