Sulfaatinpelkistäjäbakteerien DNA:n eristys ja pitoisuuden määritys kvantitatiivisella PCR:llä

Abstract

Suomen maaperässä esiintyy paljon elohopeaa, mikä on myrkyllistä monille mikrobeille. Maaperästä löytyy mikrobeja, jotka ovat kehittäneet elohopeatoleranssin. Saastuneessa maaperässä esiintyy sulfaatinpelkistäjäbakteereita (SRB), joiden solut sisältävät elohopeaa. Sulfaatinpelkistäjäbakteerit kykenevät käyttämään elohopeaa metaboliassaan muodostaen elohopeasulfidia. Tämä taas hapettuu metyylielohopeaksi, joka on elohopeaa myrkyllisempää ja kerääntyy elohopean tavoin ruokaketjussa ylöspäin. Metsäntutkimuslaitoksessa tutkitaan, miten avo- ja kokopuuhakkuut vaikuttavat elohopean liikkuvuuteen ja pitoisuuteen maaperässä. Tutkimukseen on valittu 8 suota, joista puolet on ravintorikkaalla mustaliuskemaaperällä ja puolet kallioperän päällä. Molempien maaperien 4 suota koostuivat yhdestä kontrollista, yhdestä avohakkuusuosta ja kahdesta kokopuu-hakkuusuosta. Opinnäytetyössä keskityttiin maaperän, näytesyvyyden ja suon käsittelyn vaikutuksiin sulfaatinpelkistäjäbakteerien pitoisuuksiin. Sulfaatinpelkistäjäbakteeripitoisuudet määritettiin ensin eristämällä turvenäytteistä totaali-DNA, joka inhibition takia lisäpuhdistettiin PEG-saostuksella. PCR:ssä käytettiin 16S rRNA-alukkeita, joiden avulla todettiin DNA:n eristyksen onnistuminen. Sulfaatinpelkistäjä-bakteerien määrä mitattiin spesifeillä dsrA-alukkeilla käyttäen kvantitatiivista PCR-tekniikkaa. Tuloksen mukaan soissa esiintyi vaihtelevia määriä sulfaatinpelkistäjäbakteereita läpi syvyysgradientin. Suurimmat pitoisuudet olivat 25 senttimetrin syvyydessä, mikä on loogista anaerobisuuden ja hapen rajapinnassa elämisen takia. Maaperien välillä oli eroja, sillä ravinnerikkaassa esiintyi huomattavasti enemmän sulfaatinpelkistäjäbakteereita. Suokäsittely vaikuttaa sulfaatinpelkistäjäbakteeripitoisuuksiin. Kokopuuhakkuusoilla pitoisuudet olivat korkeampia kuin kontrolli- tai avohakkuusoissa. Avopuuhakkuusoiden ja kontrollien välillä ei ollut suurta eroa. Tämä on loogista, koska kokohakkuusuon maaperä on sekoittu-nut enemmän kuin avohakkuusuon. Seuraava tutkimusvaihe on tunnistaa sulfaatinpelkistäjäbakteerit eri syvyyksistä ja eri sois-ta. Sulfaatinpelkistäjäbakteerien kyky käsitellä happea ja elohopeaa vaihtelee sukujen ja lajien välillä.Mercury can be found in Finland’s soil, and it is toxic for most microbes. There are microbes, which have resistances for mercury. Sulfate-reducing bacteria occur in polluted soil and even cells contain mercury. Sulfate-reducing bacteria can modify mercury to methyl mercury, which is more toxic than elemental mercury. Methyl mercury like mercury can accumulate to upwards in the food chain. Finnish Forest Research Institute studies how whole-tree harvesting and stem-only har-vesting impacts on the mobilization of mercury and methyl mercury from drained peatland forests. For research eight peatlands from two different soils were chosen, half located on black schistsoil and other half on rock. Both four series of peatlands included one control site, one stem-only harvesting and two whole-tree harvesting peatlands. The thesis focuses on sulfate-reducing bacteria contained in swamps that were known to include mercury. Impacts of sample depth, soil and harvesting to sulfate-reducing bacte-ria’s concentration were studied. First total-DNA was isolated, and then DNA was purified with PEG-precipitation because of high inhibition. With 16S rRNA primers sample’s DNA was confirmed in PCR. Next PCR was performed with specific dsrA primers to study sul-fate-reducing bacteria. Final concentration of sulfate-reducing bacteria was detected with qPCR. Sulfate-reducing bacteria were found on most of the samples in different depths, but the highest occurrence was in deeper layers of soil. The result was logical, because most sulfate-reducing bacteria are anaerobic and like to live in the interface of anaerobic and aerobic. Rich soil contained clearly higher concentration of sulfate-reducing bacteria than poor one. Stem-only harvesting had lower concentration of sulfate-reducing bacteria than whole-tree harvesting due to alteration of soil’s composition. The ability on sulfate-reducing bacteria to process and resist oxygen and mercury vary between genus and even between species. Also the variety of sulfate-reducing bacteria chances in different depth of soil. That’s why identification of sulfate-reducing bacteria is important