Charakterisierung der Sensor-Kinasen CitA von Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli als Citrat-Rezeptoren

Abstract

Das Zweikomponenten-Regulationssystem CitA/CitB aus dem Enterobakterium $\textit{Klebsiella pneumoniae}$ reguliert die Expression der Citratfermentations-Gene. In dieser Arbeit wurden zwei Domänen der Sensor-Kinase CitA biochemisch charakterisiert, nämlich die C-terminale Kinase-Domäne und die periplasmatische Domäne. Die isolierte Kinase-Domäne besaß konstitutive Autokinase-Aktivität und übertrug die $\gamma$- Phosphatgruppe von ATP auf den Response"-Regulator CitB. Histidin-350 und Aspartat-56 konnten als wahrscheinliche Phosphorylierungsstellen von CitA bzw. CitB identifiziert werden. In Anwesenheit von ATP bildete CitB-D56N einen stabilen Komplex mit der Kinase- Domäne, der möglicherweise auch Chancen für eine Strukturaufklärung bietet. Die periplasmatische Domäne war in der Lage, Citrat zu binden, jedoch keines der anderen getesteten Tri- und Dicarboxylate. Die Enthalpie-getriebene Bindung erfolgte mit einer Stöchiometrie von 1 und einem K$_{D}$ von 6 $\mu$M in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und bei 25°C. Die pH-Abhängigkeit der Bindung mit einer maximalen Affinität bei pH 5,7 wies darauf hin, daß H-Citrate$^{2-}$ gebunden wird. Der Mg-Citrat-Komplex wird wahrscheinlich nicht gebunden, da Mg$^{2+}$-Ionen die Citrat-Bindung inhibierten. CitA aus $\textit{K. pneumoniae}$ ist der Prototyp einer Familie von Sensor-Kinasen, deren Aminosäuresequenzen nicht nur in der C-terminalen Kinase-Domäne konserviert sind, sondern auch in der periplasmatischen Domäne und der Linker"-Domäne. In der vorliegenden Arbeit wurden noch zwei weitere Mitglieder dieser Familie untersucht, nämlich CitA und DcuS aus $\textit{Escherichia coli}$. Wie das $\textit{K. pneumoniae}$ CitA/CitB-System reguliert auch das $\textit{E. coli}$ CitA/CitB-System die Expression von Citratfermentations-Genen. Bindungsstudien mittels isothermaler Titrationskalorimetrie zeigten, daß auch die periplasmatische Domäne der Sensor-Kinase CitA von $\textit{E. coli}$ als Citrat-Rezeptor fungiert. Die Bindung erfolgte Enthalpie-getrieben mit einem K$_{D}$ von 0,3 - 0,4 $\mu$M in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,0. Ein Austausch des Glycin-Restes an Position 102 verhinderte die Citrat-Bindung. Das DcuS/DcuR-System von $\textit{E. coli}$ reguliert die Expression von Genen der Fumarat- Atmung. Eine Bindung von Fumarat oder Succinat an die periplasmatische Domäne der Sensor-Kinase DcuS konnte jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Ursache dafür ist wahrscheinlich der hohe K$_{D}$-Wert, der basierend auf physiologischen Untersuchungen im Bereich von 3-10 mM liegt

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Last time updated on May 16, 2016

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