Article thumbnail

Fluorometric methods detecting cell damage

By Jan Čapek

Abstract

Fluorescenční metody jsou specifické, citlivé a selektivní. Často jsou pro tyto vlastnosti využívány v přírodních vědách pro detekci různých buněčných parametrů. Pomocí fluorescenčních sond jsme schopni detekovat intracelulární koncentrace analytů, potenciály na membránách buněk i organel či vizualizovat buněčné organely. Cílem naší práce bylo optimalizovat spektrofluorimetrickou metodu pro rutinní detekci koncentrace glutathionu (GSH) v buňkách. Dále pak optimalizovat spektrofluorimetrickou metodu pro detekci fragmentované DNA a využít tyto, i další fluorescenční metody pro charakterizaci toxického působení CdCl2. Při detekci intracelulárních koncentrací GSH jsme využili fluorescenční sondu monochlorobiman. Při vyhodnocení získaného fluorescenčního signálu v čase jsme optimalizovali analýzu detekovaného signálu. Koncentrace glutathionu vypočtené pomocí nově vypracované metodiky jsme následně porovnali jak se standardně používaným zpracováním naměřených dat, tak i s koncentracemi GSH naměřenou pomocí referenční metody využívající o-ftalaldehyd. Kromě shodných výsledků naměřených optimalizovanou i referenční metodou jsme prokázali také velmi silnou korelaci obou metod při analýze biologických vzorků (r = 0,96). Pro spektrofluorimetrickou detekci fragmentovane DNA jsme využili sondu Hoechst 33258, pomocí které jsme detekovali signifikantní vliv vybraných modelových toxinů na proces fragmentace DNA. Nejvyšší narůst fluorescence Hoechst 33258 jsme detekovali u buněk ovlivněnych 50 a 100 ěM cisplatinou po 24 hod inkubaci. Nasledně jsme v posledni části práce detekovali změny koncentrace GSH, fragmentaci DNA, mitochondriální membránový potenciál a produkci ROS u buněk inkubovaných s CdCl2.Fluorescent methods are specific, sensitive and selective. These properties are frequently used in scientific studies to detect various cellular parameters. Using fluorescence probes, we are allowed to detect intracellular concentrations of analytes, membrane potentials in cells and organelles or to visualize cell organelles. The aim of our work was to optimize spectrofluorimetric method for routine measurement of glutathione (GSH) concentration in cells. Other partial aims of the study were to optimize the spectrofluorimetric method for the detection of fragmented DNA and to use these and other fluorometric methods to characterize the toxic effect of CdCl2. We used the fluorescent probe monochlorobiman to detect intracellular GSH concentrations. Firstly, we optimized the evaluation of fluorescence intensity signal over time. Consequently, we compared the glutathione concentrations obtained using the optimized calculation method with both the standardly used method and with the GSH levels measured using the reference o-phthalaldehyde method. We found the similarity of the results obtained using optimized and reference methods when we obtained a very strong correlation of both methods in the analysis of biological samples (r = 0.96). For spectrofluorometric detection of fragmented DNA, we used the Hoechst 33258 probe to detect a significant effect of selected model toxic compounds on DNA fragmentation. The highest increase of Hoechst 33258 fluorescence was detected in cells treated with 50 and 100 ěM cisplatin after 24 h. Subsequently, we detected changes in GSH concentration, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential and ROS production in cells incubated with CdCl2.Fakulta chemicko-technologickáDokončená práce s úspěšnou obhajobo

Topics: glutathion, monochlorobiman, fragmentace DNA, reaktivní formy kyslíku, kadmium, glutathione, monochlorobimane, DNA fragmentation, reactive oxygen species, cadmium
Publisher: 'Univerzita Pardubice'
Year: 2020
OAI identifier: oai:dk.upce.cz:10195/75958
Download PDF:
Sorry, we are unable to provide the full text but you may find it at the following location(s):
  • https://hdl.handle.net/10195/7... (external link)
  • Suggested articles


    To submit an update or takedown request for this paper, please submit an Update/Correction/Removal Request.