Article thumbnail

Methods for production of recombinant enzymes for collagen degradation

By Tea Eriksson and Elin Su

Abstract

In this thesis eight enzymes have been identified with documented ability to degrade collagen or its hydrolyzed products. Collagen can be found in skin, bones, and connective tissue. Hydrolyzed collagen peptides are utilized in food, disease treatment, skincare and training supplements. The studied enzymes are: Clostridium histolyticum collagenases ColG and ColH, Grimontia hollisae collagenase, Bacillus cereus collagenase ColA, subtilisin, trypsin, pepsin and papain. Two organisms were used to develop cloning strategies, Escherichia coli and Pichia pastoris. For E. coli the enzymes have been optimized for cytoplasmic expression with pET22b+ expression vector, for periplasmic expression with pET22b+ in frame with pelB signal peptide and for extracellular expression with pAES40 vector with YebF protein. Extracellular expression of the enzymes with P. pastoris was optimized for pPICZα expression vector with α-factor signal sequence. Two cloning strategies have been developed for the four expression systems which included subcloning, protein production and purification. Furthermore, possible methods for evaluating the produced enzymes were investigated. Additionally, a strategy to determine the most effective enzyme combination for breakdown of collagen was developed which resulted in a maximum of 16 tests. The optimized genes were compared between the species and a difference in codon bias was found as well as between different algorithms which showed that different tools gave diverse sequences. The cloning strategy developed for E. coli was experimentally tested with G. hollisae collagenase and subtilisin Carlsberg. The cloning was not successful as no growth of transformed cells were observed. It was discovered that the size of vector backbone and genes of interest caused difficulties for purification of genes, but it was postulated that with additional restriction enzymes or PCR and different competent cells the enzymes could have been successfully expressed.Kollagenrika restprodukter kan användas i värdefulla livsmedels- och läkemedelsprodukter. Enzymatisk behandling tillåter kontrollerad och effektiv nedbrytning. I det här projektet har metoder utvecklats och testats för produktion av enzymer i bakterier. Kollagen är det vanligaste proteinet i däggdjur. Proteinet finns i ben, vävnader och senor och ger mekanisk stabilitet och styrka. Den kompakta strukturen av kollagen gör molekylen svår att bryta ner. Det finns stora mängder av många olika restprodukter med höga kollagenhalter som har lågt värde och det finns därför intresse att omvandla kollagenet i de här materialen till värdefulla produkter. Detta skulle minska avfallshanteringen och därmed minska klimatpåverkan. Nedbrutet kollagen kan användas till en mängd olika tillämpningar som i kosttillskott, antioxidanter, hudvårdsprodukter och mervärdesmat. Marknaden drivs främst av stillahavsområdet i Asien där efterfrågan på näringsrik mat och dryck är hög. Åtta enzymer har valts ut och studerats. Fyra av dessa är vanligt förekommande enzymer som bryter bindningar i proteiner. De resterande fyra enzymer är kollagenaser som kan specifikt bryta ner kollagen. Generna för dessa enzymer har optimerats för insättning i cirkulära DNA-molekyler (plasmider) och tillverkning i olika celler. I det här projektet har två strategier utvecklats för produktion av enzymer för nedbrytning av kollagen eller kollagenderiverade produkter. Strategierna utvecklades för produktion av enzymer i bakterien, Escherichia coli och jästen, Pichia pastoris. E. coli växer otroligt fort och kan fördubblas på tjugo minuter men saknar förmågan att modifiera proteiner vilket jäst kan åstadkomma. I jästen är systemet utvecklat för enzymproduktion utanför organismen. Bakteriesystemen är utvecklade för tillverkning av enzymerna inuti cellen, mellan inre och yttre cellmembranen samt utanför cellen. Fördelen med att producera enzymer inuti celler är att produktionen kan bli mycket hög. Nackdelarna är att det kan vara svårt att ta ut enzymerna för att det finns många andra proteiner i celler och det krävs också att man tar sönder cellerna. Enzymer kan kombineras på många olika sätt för olika grad av nedbrytning av kollagen. Metoder för att analysera enzymerna och dess produkter har beskrivits. En försöksplanering designades för att med så få försök som möjligt upptäcka den mest effektiva kombinationen. För att få reda på vilket eller vilka enzymer som har bäst nedbrytningskapacitet behöver försöksplaneringen testas experimentellt. Två enzymer valdes ut för experimentell framställning i E. coli mellan cellmembranen. Först måste de optimerade generna erhållas. Därefter behöver generna klippas ut och sättas in i plasmider som innehåller delarna som behövs för uttryck av protein. Plasmider med insatta gener kan tas upp av celler för att producera enzymerna. Selektering med antibiotika används för att välja ut de celler som bär på plasmiden med genen för enzymet. Selekteringen visade att experimenten inte hade lyckats. Experimenten fick avbrytas vid det här steget men med mer tid hade framställningen haft stor potential att lyckas

Topics: Collagenase, Subtilisin, Collagen, Enzymatic hydrolysis, Enzymes, Collagen degradation, Enzyme production, Cloning, Gene optimization, Protein expression, Technology and Engineering
Publisher: Lunds universitet/Teoretisk kemi
Year: 2020
OAI identifier: oai:lup-student-papers.lub.lu.se:9014516
Download PDF:
Sorry, we are unable to provide the full text but you may find it at the following location(s):
  • http://lup.lub.lu.se/student-p... (external link)

  • To submit an update or takedown request for this paper, please submit an Update/Correction/Removal Request.

    Suggested articles