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Extração de DNA genômico de tecidos foliares maduros de espécies nativas do cerrado Extraction of genomic DNA from leaf tissues of mature native species of the cerrado

By Márcia Nara da Silva

Abstract

Grandes quantidades de contaminantes na amostra de DNA dificultam a obtenção de DNA genômico de qualidade durante a extração. A presença de polissacarídeos, fenóis e outros compostos secundários representa o principal problema com o procedimento de isolamento do DNA e sua aplicação subsequente, por inibir a atividade das enzimas Taq DNA polimera-se e enzimas de restrição. Neste estudo, descreveu-se um procedimento modificado baseado no hexadecyltrimethylammonium (CTAB), rendendo DNA genômico satisfatório para técnicas de manipulação subsequente, como reações de PCR e digestão com enzima de restrição. Nesse protocolo foram utilizadas diferentes concentrações de &#946;-mercaptoetanol no tampão de extração (0,0; 0,2; 10; 15; 25; e 50 uL de &#946;-mercaptoetanol/mL do tampão de extração: 100 mM de Tris-HCl, pH 8; 20 mM de EDTA; 1,4 mM de NaCl; 2% de CTAB; 1% de PVP), cujo procedimento foi aplicado no caso de folhas maduras e testado em Annona crassiflora (arati-cum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliense (pequi). O protocolo foi eficiente no isolamento de DNA livre de polissacarídeos e polifenóis, com rendimento do DNA com alto peso molecu-lar, utilizando-se concentrações a partir de 1% de &#946;-mercaptoetanol no tampão de extração. O DNA isolado por esse método mostrou alta pureza, de acordo com as análises de digestão por restrição e amplificação por PCR.<br>Great amounts of contaminants in DNA samples hamper the extraction of high-quality genomic DNA. The main problem is the presence of polysaccharides, phenols and other secondary metabolites that impair the DNA isolation procedure and subsequent application, by inhibiting the Taq DNA polymerase and restriction enzyme activity. This study describes a modified procedure based on hexadecyltrimethylammonium (CTAB) from which genomic DNA, ap-propriate for subsequent manipulation such as PCR reactions and restriction enzyme diges-tion, is derived. This protocol uses different &#946;-mercaptoethanol concentrations in the extrac-tion buffer ( 0.0; 0.2; 10 ; 15; 25 and 50 uL &#946;-mercaptoethanol/ml from the extraction buffer: 100mM Tris-HCl, pH 8 ; 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl ; 2% CTAB; 1% PVP ). The procedure was tested on mature leaves of Annona crassiflora (araticum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliensis (pequi ).The protocol was efficient in the isolation of polysaccharide and polyphenol-free DNA of high molecular weight using &#946;-mercaptoethanol concentrations of over 1 % in the extraction buffer. The purity of thereby isolated DNA isolated was high according to the di-gestion analyses by PCR restriction and amplification

Topics: Annona crassiflora (araticum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Annona crassiflora (araticum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), LCC:Forestry, LCC:SD1-669.5, LCC:Agriculture, LCC:S, DOAJ:Forestry, DOAJ:Agriculture and Food Sciences
Publisher: Sociedade de Investigações Florestais
Year: 2010
DOI identifier: 10.1590/S0100-67622010000600002
OAI identifier: oai:doaj.org/article:0661a6779f3542708acf8134d3e2c638
Journal:
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