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Desenvolvimento de circuito sintético lógico para controle preciso e eficiente da expressão gênica em Saccharomyces cerevisiae

By Daniela Vieira Duarte

Abstract

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.A Biotecnologia tem avançado cada vez mais no sentido de modificar organismos para gerar células que produzam de forma eficiente e com menor desvio metabólico um produto de interesse. Os circuitos sintéticos genéticos, produto da Biologia Sintética, podem ser utilizados para modular a expressão de diversos genes, inclusive para o controle de genes específicos de vias metabólicas de forma mais precisa. Os circuitos também podem alterar a expressão de genes dependendo de estímulos externos em um biorreator, por exemplo. A construção de circuitos sintéticos lógico com o objetivo de desenvolver organismos biológicos artificiais com comportamento previsível e regulável tem sido o maior desafio. A utilização de ferramentas como as integrases para a construção de circuitos sintéticos baseados na lógica Booleana já foram utilizadas em bactérias, plantas e em células de mamíferos. Recentemente, foram caracterizadas 11 integrases ortogonais e não há relatos de sua utilização na construção de circuitos em Saccharomyces cerevisiae até o momento. Portanto, foi construído um circuito sintético lógico do tipo XOR (Ou exclusivo) utilizando as integrases 4, 5 e 8. Como sinais de entrada foram usados o cobre e a galactose e o sinal de saída foi a emissão de fluorescência da GFP (Green fluorescente protein). Entretanto, esse circuito não foi funcional. Com o objetivo de verificar os possíveis problemas passamos a estudar a funcionalidade das integrases individualmente. Avaliamos as integrases 4 e 8 sob o controle do promotor responsivo a galactose (PGal1/Gal10). A integrase 4 apresentou a capacidade de ativar o dispositivo genético ao contrário da integrase 8. Portanto, a integrase 4 se mostra funcional em levedura, abrindo caminho para a utilização de integrases como novas ferramentas moleculares para o desenvolvimento e construção de circuitos sintéticos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Biotecnology field has advanced in recent years to modify organisms to generate cells that synthetize a product of interest more efficiently and with less metabolic deviation, as well as to develop organisms with new functions. Synthetic circuits, a recent product of the evolution of synthetic biology, could be used to modulate the expression of several genes, including the control of specific genes of metabolic pathways in a more precise way. Circuits can also alter the expression of genes depending on external stimuli like in a bioreactor, for example. The design of synthetic genetic circuits aiming the development of artificial biological organisms with adjustable and predictable behavior has been a great challenge. The utilization of molecular tools such as integrases for the construction of genetic circuits based on Boolean logic is already being carried out in bacteria, in plants and mammalian cells. Recently, 11 orthogonal integrase have been characterized and there is no report on their use in the yeast S. cerevisiae so far. Therefore, a synthetic XOR (exclusive OR) genetic circuit was developed using integrases 4, 5 and 8. The inputs used were cooper and galactose and the output was the fluorescence of GFP (Green fluorescent Protein). However, the circuit was not functional. Aiming to identify the possible problems, we studied the functionality of the integrases individually. Integrases 4 and 8 were tested under the control of a promoter responsive to galactose (PGal1/Gal10). The Integrase 4 was able to activate he genetic switch, unlike integrase 8. Thus we have shown that integrase 4 was functional in yeast, paving the way to the utilization of these integrases as a new molecular tool for the development and construction of genetic circuits in yeasts

Topics: Biotecnologia, Circuito sintético, Organismos biológicos artificiais, Saccharomyces cerevisiae
Year: 2019
OAI identifier: oai:repositorio.unb.br:10482/35547

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