10.17169/refubium-15973

Molekulare Charakterisierung der RING E3 Ubiquitin Ligase LIN41/TRIM71 in der frühen Neurogenese

Abstract

The RING E3 ubiquitin ligases TRIM2, TRIM3, TRIM32 and LIN41/TRIM71 form the mammalian TRIM-NHL protein family. They contain a characteristic domain structure consisting of an N-terminal tripartite motif (TRIM) and a C-terminal NHL domain. The TRIM-NHL proteins have reciprocal expression patterns in development: LIN41 is highly expressed in stem cells and early embryos and is downregulated during development, while expression of the other family members TRIM2, TRIM3 and TRIM32 increases. Relatively little was known about the function of TRIM-NHL proteins at the beginning of this thesis. In pluripotent cells, LIN41 was shown to target ARGONAUTE2, the effector protein in the RNA- induced silencing complex, for proteasomal degradation resulting in a repression of microRNA activity. During differentiation, Lin41 is efficiently downregulated at the transcriptional and at the post-transcriptional levels, the latter by the combined action of let-7 and miR-125 (two differentiation- associated microRNA). Homozygous Lin41 gene trap mice showed embryonic lethality. Knockout mice of the other TRIM-NHL proteins were viable and displayed various central nervous system phenotypes. The goal of the thesis was to investigate potentially shared functions of TRIM-NHL proteins. Therefore it was determined if TRIM32 and LIN41 interact with MYOSIN V (like TRIM2 and TRIM3) and if LIN41 influences endosomal trafficking (like TRIM3). The results presented in this thesis indicate that LIN41 and TRIM32 bind MYOSIN V, but (unlike TRIM3) LIN41 does not influence endosomal trafficking. Furthermore, the question of a LIN41 effect on pluripotency and of a possible regulation of microRNA activity by the other TRIM-NHL proteins was addressed. The results suggest that LIN41 affects pluripotency only indirectly and that TRIM32, but not TRIM2 or TRIM3, is able to mimic LIN41 function in a microRNA sensor assay. The major focus of this thesis was to investigate the potential interplay between LIN41 and the other TRIM-NHL family members in early neurodevelopment. In C. elegans, loss of the Trim32 ortholog was reported to rescue the heterochronic phenotype of a hypomorphic lin-41 mutant, demonstrating a genetic interaction between the two. To date, the idea that mammalian TRIM-NHL proteins may directly and functionally interact has been largely neglected. Using co-immunostaining, co-localization of all three other TRIM-NHLs with LIN41 in cytoplasmatic foci of transfected cells was observed. In sections of E11.5 embryos, co-staining of the four TRIM-NHL proteins in the neuroepithelium was shown. Unexpectedly, the four TRIM-NHL proteins were also co-expressed in pluripotent embryonic stem cells. Co-immunoprecipitation employing E11.5 head extracts revealed an RNA-independent physical interaction of TRIM2, TRIM3 and TRIM32 with LIN41. As all four TRIM-NHL proteins are functional RING E3 ubiquitin ligases, this result indicates that they may act in a combinatorial fashion. Mutual ubiquitination or change of target specificity upon interaction of LIN41 and TRIM32 (which showed an almost complete co-localization) was hypothesized. Indeed, LIN41 overexpression in embryonic stem cells led to downregulation of TRIM32. Analysis of the global ubiquitination landscape of embryonic stem cells revealed LIN41-driven ubiquitination of TRIM32. TRIM32 is a pro-differentiation factor in neural stem cells and enhances retinoic acid signaling. This suggests that LIN41 may prevent premature differentiation of pluripotent cells at least in part by regulating TRIM32 activity. Together, this research provides novel insight into the developmental roles of LIN41 by elucidating its functional interaction with other members of the TRIM-NHL family during mammalian neurodevelopment.Die RING E3 Ubiquitinligasen TRIM2, TRIM3, TRIM32 und LIN41/TRIM71 bilden mit ihrer charakteristischen Domänenstruktur, einer N-terminalen TRIM (tripartite motif) und einer C-terminalen NHL-Domäne, die TRIM-NHL Proteinfamilie. In der Säugetierentwicklung weisen TRIM-NHL Proteine entgegengesetzte Expressionsmuster auf: LIN41 ist in Stamzellen und in frühen Entwicklungsstadien stark exprimiert. Diese Expression wird im Verlauf der Entwicklung herunterreguliert, während die Expression von TRIM2, TRIM3 und TRIM32 ansteigt. Die Funktion der TRIM-NHL Proteine war zu Beginn der hier vorliegenden Dissertation weitestgehend unbekannt. Für LIN41 war bereits beschrieben, dass es in pluripotenten Zellen ARGONAUTE2 (das Mediatorprotein für microRNA-Funktion) für proteasomalen Abbau markiert und dadurch zu verringerter microRNA Aktivität führte. Während der Differenzierung wird nicht nur die Transkription von Lin41 verringert, auch bereits bestehende Lin41 mRNA wird durch let-7 (eine differenzierungs-assoziierte microRNA) reprimiert. Homozygote Tiere des Lin41 “gene trap knockout“ Mausmodells sind nicht überlebensfähig und sterben in der Embryonalphase. Mäuse, die homozygot für die Deletion des TRIM2, TRIM3 oder TRIM32 Gens sind, sind hingegen überlebensfähig; jedoch weisen die Tiere Missbildungen und Fehlfunktionen im Zentralnervensystem auf. Ziel der hier vorliegenden Doktorarbeit war es herauszufinden ob TRIM-NHL Proteine generell ähnliche Funktionen ausführen können. Es wurde untersucht ob TRIM32 und LIN41 mit MYOSIN Va interagieren (so wie TRIM2 und TRIM3) und ob LIN41, wie TRIM3, den Transport von Endosomen steuert. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, deuten darauf hin, dass LIN41 und TRIM32 MYOSIN Va binden, aber LIN41 den endosomalen Transport nicht reguliert. Weiterhin war von Interesse ob der Verlust von LIN41 Auswirkung auf die Pluripotenz der Zellen hat und ob die gesamte TRIM- NHL Familie in der Lage ist die Aktivität von microRNAs zu regulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass der LIN41-Verlust nur indirekte Auswirkung auf Pluripotenzfaktoren hat und dass TRIM32, nicht aber TRIM2 oder TRIM3, in der Lage ist die LIN41-Funktion im microRNA Sensorversuch zu übernehmen. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf einer potentiellen Wechselwirkung der TRIM-NHL Proteine untereinander in den frühen Phasen der Nerven-systementwicklung im Säugetier. Im Wurm C. elegans wurde bereits ein genetischer Zusammenhang zwischen den orthologen Proteinen von TRIM32 und LIN41 gezeigt: eine zusätzliche Deletion des Trim32 Orthologs kompensierte den Phänotyp der Lin-41 Mutante. Aufgrund dieser genetischen Interaktion sollte in dieser Doktorarbeit die Möglichkeit einer direkten Interaktion geprüft werden. Mittels Doppelfärbung transfizierter Zellen konnte gezeigt werden, dass die anderen drei TRIM-NHL Proteine in den gleichen zytoplasmatischen Aggregaten auffindbar sind wie LIN41. Färbungen von E11.5 Mausembryonen bestätigten, dass alle vier TRIM-NHL Protein im Neuroepithel exprimiert werden. Immunfärbungen verschiedener Stammzelllinien zeigten überrasschenderweise, dass alle TRIM-NHL Proteine, nicht nur LIN41, in pluripotenten Zellen exprimiert werden. TRIM2, TRIM3 und TRIM32 befinden sich nicht nur zufällig in denselben Aggregaten wie LIN41, die Proteine interagieren physikalisch miteinander. Diese Interaktion konnte sowohl in Überexpressionsversuchen als auch mit Proteinlysaten von E11.5 Embryoköpfen gezeigt werden. Alle TRIM NHL Proteine sind funktionale E3 Ubiquitinligasen, daher liegen funktionelle Folgen der Interaktion Nahe. Die Hypothese war, dass LIN41 und TRIM32 (das die exakteste Übereinstimmung im Lokalisationsexperiment aufwies) sich möglicherweise gegenseitig ubiquitinieren oder ihre Zielproteinspezifität beeinflussen. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese führte die Induktion von LIN41 in Stamzellen zu einer verringerten TRIM32 Expression. Eine Analyse des globalen Ubiquitinierungsprofils von Stammzellen deutet darauf hin, dass TRIM32 Ubiquitinierung tatsächlich von LIN41 hervorgerufen werden kann. TRIM32 hat einen positiven Einfluss auf die Differenzierung, in dem es Retinolsäuresignale verstärkt. Somit verhindert LIN41 eventuell eine frühzeitige Differenzierung von Stammzellen, indem es TRIM32 ubiquitiniert und dadurch seinen Abbau einleitet. Durch die Untersuchung der TRIM-NHL Proteinwechselwirkung liefert die hier vorliegende Doktorarbeit neue Erkenntnisse über die Funktion von LIN41 in der Entwicklung des zentralen Nervensystems

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