Characterization of the hepatitis delta virus small antigen: intracellular localization, structure, multimerization and RNA binding ability

Abstract

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente patogénico responsável por uma das formas mais severas de hepatite viral. O genoma consiste numa molécula circular de RNA de cadeia simples de polaridade negativa e apresenta uma única proteína viral, o antigénio delta pequeno (S-HDAg). Na sequência de um mecanismo de editing outra proteína viral é traduzida, o antigénio delta grande (L-HDAg). Apesar de partilharem grande parte da sua sequência, as duas proteínas desempenham funções distintas. O S-HDAg é essencial para a acumulação de RNAs virais enquanto o L-HDAg inibe a replicação viral e é necessário para o empacotamento. O HDV depende extensivamente de factores do hospedeiro para completar o seu ciclo de replicação. Pensa-se que a polymerase II (pol II) do hospedeiro é redireccionada para transcrever o RNA viral. No presente trabalho procurou-se caracterizar o S-HDAg e clarificar o seu papel no ciclo de replicação do HDV. Observamos que quando o S-HDAg é expresso na presença de replicação do RNA viral, o antigénio co-localiza com a pol II. Contudo, a co-localização com pol II verifica-se mesmo na presença de RNA viral incapaz de ser replicado e na ocorrência de inibição da replicação viral, sugerindo que o S-HDAg não participa directamente na transcrição do RNA viral. Assim, propomos que o S-HDAg é essencial para acumulação de RNAs virais protegendo ou estabilizando os RNAs. Observamos ainda que na ausência de RNA viral o S-HDAg co-localiza com a nucleolina nos nucléolos. Contudo, na presença de RNA incapaz de ser replicado, o antigénio desloca-se para o nucleoplasma mantendo-se a nucleolina nos nucléolos, sugerindo que o S-HDAg não interage directamente com a nucleolina. Ao estudarmos as características estruturais do S-HDAg verificámos, utilizando um preditor de desordem intrínseca, que apresenta um elevado grau de desordem. A previsão foi confirmada in vitro por dicroísmo circular observando-se que apenas 30% dos amino ácidos adoptam uma conformação de hélice . A ausência de uma estrutura rígida pode conferir ao antigénio flexibilidade para se adaptar a diferentes parceiros e participar em vários passos do ciclo de replicação viral. A multimerização do S-HDAg foi analisada por dispersão de luz dinâmica. Os resultados indicam que o antigénio recombinante purificado é capaz de formar multímeros de 12 moléculas. Adicionalmente, foram observados multímeros de seis a oito moléculas em gel de poliacrilamida desnaturante, após cross-linking. Os mesmos multímeros foram observados para S-HDAg presente em partículas virais sugerindo que a multimerização do antigénio ocorre in vivo. Finalmente, estudamos a capacidade do S-HDAg interagir com ácidos nucleicos. Verificamos que multímeros e monómeros de S-HDAg são capazes de interagir in vitro com RNA e DNA. A falta de especificidade observada pode dever-se apenas a interacções electrostáticas entre o S-HDAg de carga positiva (+12) e ácidos nucleicos de carga negativa. Propomos que, in vivo, a fosforilação extensiva do S-HDAg reduza a carga positiva contribuindo para que a interacção seja específica para os RNAs virais.Hepatitis delta virus (HDV) is the causative agent of one of the most severe forms of viral hepatitis. It has a small single-stranded circular RNA genome of negative polarity and only one viral protein, the small delta antigen (S-HDAg). Following site-specific RNA editing, a second longer protein is translated, the large delta antigen (L-HDAg). Although these viral proteins share most of their sequence they play distinct roles. S-HDAg is essential for the accumulation of HDV RNAs whereas L-HDAg inhibits HDV replication and is necessary for viral assembly. With such a limited coding capacity HDV must rely extensively on host cell components to complete its replication cycle. The host DNA-directed RNA polymerase II (pol II) is thought to be re-directed to transcribe HDV RNAs. The objective of this study was to further characterize S-HDAg and clarify its role(s) during the HDV replication cycle. We observed that when S-HDAg was expressed in vivo along with replicating HDV RNA it co-located with host pol II. However, such co-localization was also observed in the presence of non-replicating HDV RNAs or when replication was inhibited by specific doses of -amanitin. Thus, we propose that S-HDAg is essential for HDV RNA accumulation by stabilizing or protecting the viral RNAs rather than acting as a direct player in HDV RNA transcription. Additionally, we observed that S-HDAg located in nucleolus when expressed in the absence of HDV RNA, and co-located with host nucleolin. However, in the presence of non-replicating HDV RNAs, S-HDAg moved to the nucleoplasm whereas nucleolin was unchanged. This suggests that S-HDAg is not interacting directly with nucleolin. In our examination of S-HDAg‟s structural features we applied a meta-predictor of intrinsic disorder, PONDR-FIT. It predicted that full-length S-HDAg has extensive intrinsic disorder. This result was confirmed in vitro by circular dichroism measurements that indicated no more than 30% of S-HDAg amino acids adopted an -helical structure. Such a lack of a well-defined rigid structure is expected to grant flexibility to the antigen allowing it to interact with several partners and perform distinct roles during the HDV replication cycle. Protein multimerization was studied by dynamic light scattering. Data analysis indicated that purified recombinant S-HDAg was able to assemble into homomultimers as high as dodecamers. Similarly, denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with prior cross-linking indicated formation of at least hexamers and octamers. Similar multimers were observed for S-HDAg present in virus-like particles indicating that S-HDAg multimerization also occurs in vivo.Finally we examined the ability of S-HDAg to bind nucleic acids in vitro. Both multimers and monomers bound to conformations of both RNA and DNA. Such a lack of specificity was probably due to electrostatic interactions between the positively-charged S-HDAg (+12) and negatively-charged nucleic acids. We propose that in vivo, extensive post-translational phosphorylation of S-HDAg reduces the positive charge, thereby contributing to interactions more specific for HDV RNAs and possibly dependent upon protein multimerization. Despite our observations presented here, some issues relating to our aims remain unresolved

Similar works

Full text

thumbnail-image

Repositório da Universidade Nova de Lisboa

Provided a free PDF
oai:run.unl.pt:10362/19280Last time updated on 5/11/2018View original full text link

This paper was published in Repositório da Universidade Nova de Lisboa.

Having an issue?

Is data on this page outdated, violates copyrights or anything else? Report the problem now and we will take corresponding actions after reviewing your request.