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Development of native electrophoretic techniques for the isolation and characterization of mitochondrial complexes

By Zibirnisa Kadeer


In the first part of this work, the development of a novel two-dimensional native gel electrophoretic system (2-D BN/hrCNE) is described. This new system simplifies proteomics and biochemical analysis of mega protein complexes that are dissociated into the constituent complexes during 2-D electrophoresis, thereby reducing the complexity of the system considerably. This technique is exceptionally well suited for the in-gel detection of fluorescence-labeled proteins and the identification of individual enzymes and protein complexes by specific in-gel assays on native gels.\ud In the second part, a new technique for the native immunoblotting of blue native gels (NIBN) was developed. This new technique allows for the identification of conformation-specific antibodies and the discrimination of antibodies recognizing linear epitopes of denatured proteins. Identification of conformation-specific antibodies is becoming increasingly important not only for the electron microscopic identification of native proteins but also for structural investigations in general. For this purpose, a commonly used protocol for Western blotting of blue native gels was modified in such a way that the native state of proteins and protein complexes was retained throughout the complete protocol. Instead of using the denaturing methanol in Western blotting protocols, mild detergents such as Tween 20, digitonin and Brij 35 were used for the obligatory removal of protein bound Coomassie-dye.\ud The detection of respiratory complex I by activity staining on the blot membrane demonstrated that all three non-ionic detergents preserved the native state of complex I. The native state of the enzyme on the blot membrane was also monitored and confirmed with the help of a set of conformation-specific antibodies. NIBN can be used as a simple alternative method to the demanding native ELISA to screen for conformation-specific antibodies for structural studies. Unlike the time consuming native ELISA, NIBN does not require introduction of appropriate affinity tags and purification of the target protein by chromatography. Thus, the NIBN technique is especially useful for microscale projects and for proteins not easily accessible to genetic manipulation.\ud The third part aimed at identification of the immediate protein interaction partners of Cox26, a hydrophobic protein that has been identified by our group as a novel component of yeast respiratory supercomplex. Multi-dimensional electrophoretic techniques were applied to identify non-covalent and covalent protein-protein interactions of Cox26. Three-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS-PAGE) gave both qualitative and quantitative information on covalent and non-covalent interactions of Cox26 and subunits of cytochrome c oxidase (complex IV), and showed that most of the Cox26 protein was non-covalently bound to the complex IV moiety of the respirasomes. Four-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS/SDS-PAGE) applying reducing and non-reducing conditions revealed that a minor fraction of Cox26 used a single cysteine residue in the center of a predicted transmembrane helix to form a disulfide bond with the Cox2 subunit of complex IV. A structural role of Cox26 protein in the assembly/stability of respiratory strings or patches has been suggested.\ud The last part of this work focused on the isolation and characterization of native and morphologically intact nucleoids from bovine heart mitochondria, since only a few studies on nucleoid organization and composition have been carried out on mammalian tissues. The nucleoids appeared as distinct bands (apparent mass around 30-36 MDa) in blue native-PAGE on large pore gels. The moderate variation in particle size seems to reflect variations in the binding of loosely nucleoid-associated components like respiratory chain complexes. The estimated 30-36 MDa mass of nucleoids on native gels suggested that each nucleoid contains one mtDNA molecule provided that nucleoids contains equal amounts of DNA, protein and RNA (Miyakawa et al., 1987).\ud Electron microscopic analysis of native nucleoids, which was performed by Dr. Karen Davies from the Max-Planck-Institute of Biophysics, Department of Structural Biology, Frankfurt, showed homogenous pool of particles with dimensions in 85x100 nm (in negative stain) and 100x150 nm (in cryo-tomography). Some of the nucleoids showed dumbbell-shape indicating dimerization of nucleoids. Recent EM and high-resolution light microscopy analysis of mammalian nucleoids have reported that nucleoids have a size of 70 nm in average. We also observed the same size of 70 nm in cryo-tomogramms when we applied harsher treatment of the native nucleoid particles with dimensions 100x150 nm. This observation is in agreement with published nucleoid sizes from both EM and high-resolution light microscopy, if we assume that native nucleoids have been dissociated under harsher treatment.\ud The protein composition of bovine heart mt-nucleoids was analyzed by a number of complementary approaches to identify low and highly abundant, easily dissociating and tightly bound proteins, and to rank the 90 most abundant mt-nucleoid proteins. Native and denaturing gel electrophoresis techniques were coupled to LC-MS/MS to achieve a comprehensive protein component analysis. Qualitative MS analysis of highly purified nucleoids identified more than 400 proteins, including well known nucleoid proteins such as mitochondrial transcription factor and mtDNA-binding protein (TFAM), mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB), mitochondrial DNA polymerase subunit gamma-2 (POLG2) and mitochondrial helicase C26H10ORF2 protein (Twinkle). These proteins were ranked according to Mascot scores, and sorted according to presumed functional properties. A large group of proteins involved in protein synthesis comprised an almost complete set of subunits of mitochondrial ribosomes suggesting that the nucleoids contained significant amounts of mitochondrial ribosomes. Identification of sixty six proteins from the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system comprising around 100 proteins in total suggested that OXPHOS proteins are also associated with mt-nucleoids.\ud Interestingly, TFAM, described as a main mtDNA packaging factor in human and other mammalian cells, was not confirmed here as a major nucleoid component from bovine heart mitochondria. Fluorescence staining of protein spots on 2-D IEF/SDS gels clearly identified TFAM, but according to the stain intensity, this protein did not rank in the list of the 90 most abundant nucleoid proteins. Western blot analysis of sucrose gradient fractions revealed an enrichment of putative TFAM isoform in nucleoid fractions. Unexpectedly, the uncharacterized mitochondrial protein Es1 was identified as the most abundant nucleoid protein in bovine heart nucleoids instead. This implicates that nucleoid organization may differ between species and tissues. A functional characterization of Es1 is required to clarify its role in mammalian nucleoids.Das erste Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen zwei-dimensionalen Elektrophoresesystems, bei dem der native Zustand von Proteinen und Proteinkomplexen in beiden aufeinanderfolgenden Laufrichtungen erhalten bleiben sollte. Damit sollte die proteinchemische und biochemische Untersuchung riesiger Proteinkomplexe, wie der Superkomplexe der mitochondrialen Atmungskette, wesentlich erleichtert werden. Gleichzeitig sollten die gravierenden Nachteile der bisher bekannten zwei-dimensionalen Blau-Nativ Elektrophorese (2-D BN/BN Elektrophorese) vermieden werden. Dieses System hat nämlich den Nachteil, dass der verwendete Coomassie-Farbstoff in der zweiten Dimension der Elektrophorese die In-Gel-Farbreaktionen und die Detektierbarkeit von Fluoreszenz-markierten Proteinen beträchtlich stört. Deswegen wurde im neuen 2-D Elektrophoresesystem (2-D BN/hrCNE) die sogenannte “high-resolution clear native electrophoresis“ (hrCNE) für die zweite Laufrichtung verwendet, die eine ungestörte Proteinidentifizierung im Gel über Fluoreszenzmarkierung und enzymatische Tests erlaubt. Diese neue Kombination zweier Nativ-Elektrophoresen (BNE und hrCNE) vereinfacht proteomische und biochemische Analysen von Superkomplexen, weil BNE zur Isolierung von Superkomplexen geeignet ist und die nachfolgende hrCNE, Einzelkomplexe aus den Superkomplexen abspaltet und voneinander trennt. Damit wird die Komplexität des Systems beträchtlich reduziert. Das System eignet sich besonders für die Identifizierung von Membranproteinkomplexen anhand spezifischer Fluoreszenzmarkierungen oder anhand ihrer enzymatischen Eigenschaften, die direkt im Nativ-Gel analysiert werden können. Verwendung fand dieser Ansatz vor allem bei der Identifizierung und Charakterisierung von Superkomplexen der mitochondrialen Atmungskette aus unterschiedlichen Spezies und Geweben. Die Analyse der obligat aeroben Hefe Yarrowia lipolytica führte zur Identifizierung bisher nicht bekannter Typen von Superkomplexen.\ud Ein zweites Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer Methode für das Native Immunoblotting von Blau-Nativen Gelen (NIBN). Die neue Technik sollte die Identifizierung von konformationsspezifischen Antikörpern ermöglichen und die Unterscheidung von Antikörpern erlauben, die lineare Epitope von denaturierten Proteinen erkennen. Dies wird immer wichtiger für die elektronenmikroskopische Identifizierung von nativen Proteinen und generell für Strukturuntersuchungen. Zu diesem Zweck wurde ein allgemein verwendetes Protokoll für den Western Blott von Blau-Nativen Gelen auf solche Art und Weise modifiziert, dass der native Zustand von Proteinen und Protein-Komplexen in jedem Teilschritt des Protokolls bewahrt wurde. Anstelle des in Western Blott üblicherweise verwendeten Methanols, der leicht zur Proteindenaturierung führt, wurden milde Detergenzien wie Tween 20, Digitonin oder Brij 35 zur Entfärbung des Blotts verwendet. Als Modell für die Methodenentwicklung diente der größte und komplizierteste Atmungskettenkomplex aus Y. lipolytica, die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I). Der native Zustand des Enzyms auf der Blott-Membran wurde anschließend durch Aktivitätsfärbung überprüft. Aktivitätsfärbungen des Komplex I auf der Membran, die mit milden Detergentien gewaschen wurden zeigten, dass die NADH Oxidationsdomäne des Enzymes nach Entfernung des Coomassie-Farbstoffes immer noch funktionell blieb. Dies wurde auch durch Verwendung monoklonaler Antikörper, die ausschließlich unter nativen Bedingungen an Komplex I binden, bestätigt. NIBN kann als eine einfache alternative Methode an Stelle des technisch anspruchsvollen und aufwändigen nativen ELISA verwendet werden, wenn ein Fundus von Antikörpern nach konformationsspezifischen Antikörpern für strukturelle, meist elektronenmikroskopische Studien durchsucht werden soll. Im Vergleich zur aufwändigen Probenvorbereitung beim nativen ELISA mit Affinitätschromatographie und Proteinaufreinigung, spart NIBN viel Zeit, weil keine “affinity-tags” in Proteine eingebaut werden müssen und keine Affinitätschromatograpie gebraucht wird. Die native Elektrophorese übernimmt selbst die Isolierung des interessierenden Proteins oder Proteinkomplexes. Besonders wertvoll ist die NIBN-Technik für Proben, die nicht leicht einer genetischen Manipulation und der Einführung von “affinity-tags” zugänglich sind.\ud Der dritte Teil der Arbeit hatte zum Ziel, die direkten Protein-Protein Kontakte von Cox26, einem hydrophoben Protein, zu ermitteln, das Schägger und Kollegen in Hefe-Superkomplexen (Respirasome) identifiziert hatten. Die Superkomplexe von S. cerevisiae, die aus den Komplexen III und IV zusammengesetzt sind, enthalten mindestens 21 Untereinheiten. Zehn Untereinheiten davon sind dem Komplex III zuzurechnen und elf Untereinheiten dem Komplex IV. All diese Untereinheiten waren zunächst als potentielle Nachbarn des Cox26 Proteins anzusehen. Um die tatsächlich vorliegenden Topologien zu ermitteln, wurden multi-dimensionale elektrophoretische Techniken angewendet, die geeignet sind kovalente und nicht-kovalente Protein-Protein Wechselwirkungen von Cox26 zu identifizieren. Drei-dimensionale Elektrophorese (BN/BN/SDS-PAGE) zeigte, dass der Hauptanteil aller Cox26 Proteine nicht-kovalent an die Komplex IV-Komponente der Respirasome gebunden war. Vier-dimensionale Elektrophorese (BN/BN/SDS/SDS-PAGE) unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, dass ein geringer Anteil der Cox26 Proteine an einen Cysteinrest der Cox2-Untereinheit des Komplex IV unter Ausbildung einer Disulfid-Brücke gebunden war. Dies legte nahe, dass Cox26 eine spezielle Rolle für den Komplex IV spielt, obwohl bisher keine konkrete Funktion nachgewiesen werden konnte und bei Cox26-Defizienz kein spezieller Phänotyp auftritt. Auf der Grundlage eines Strukturmodells des Hefe-Respirasoms und mit der neuen Erkenntnis, dass eine Disulfid-Brücke zwischen Cox2 und Cox 26 existiert, wurde eine strukturelle Rolle des Cox26 Proteins für die Assemblierung und/oder Stabilität von respiratorischen Ketten oder Netzen vorgeschlagen.\ud Der vierte Abschnitt dieser Arbeit hatte die Isolierung und Charakterisierung von nativen und morphologisch intakten Nucleoiden aus Rinderherzmitochondrien zum Ziel. Mitochondrien besitzen eine eigene mitochondriale DNA (mtDNA), die im Matrixraum lokalisiert ist. ..

Topics: ddc:570
Year: 2013
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