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The four UDP-glucose dehydrogenases from Arabidopsis thaliana and their role in synthesis of cell wall polysaccharides

By Michaela Katharina Karla Klinghammer

Abstract

Die Zellwand von Arabidopsis thaliana enthält große Menge an Hemicellulosen und Pektinen, deren Bestandteile sich hauptsächlich von UDP-Glucuronsäure ableiten. Die Bildung von UDP-Glucuronsäure wird in Pflanzen überwiegend durch die UDP-Glucose Dehydrogenase (UGD) katalysiert, die UDP-Glucose unter der Bildung von NADH in UDP-Glucuronsäure umwandelt. Arabidopsis thaliana besitzt vier UGD-Gene und ein Pseudogen, welche starke Homologien zu Genen anderer bekannter pflanzlicher UDP-Glucose Dehydrogenasen zeigen. Mit Hilfe von Promotor::GUS-Reportergenpflanzen und real time-PCR-Analysen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier UGD-Gene nicht nur in verschiedenen Geweben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Morphogenese exprimiert werden, sondern auch in unterschiedlicher Stärke. Dabei scheint jedoch zu jedem Zeitpunkt der Morphogenese, bis auf die Samenentwicklung, eine der vier UGD-Isoformen in Arabidopsis thaliana exprimiert zu werden. Eine biochemische Charakterisierung der verschiedenen Isoformen zeigte einen sehr ähnlichen Km-Wert von ca. 43 µM für NAD+, während sich die Km-Werte für UDP-Glucose deutlich voneinander unterschieden (123 - 335µM). Alle Isoformen unterlagen einer feedback-Hemmung durch UDP-Xylose. Dabei war eine starke Hemmung durch UDP-Xylose korreliert mit einer hohen Affinität zu UDP-Glucose. Neben NAD+ konnten alle untersuchten Isoformen in geringem Maße auch NADP+ als Cofaktor verwenden. Allerdings verringerte sich die Enzymaktivität dadurch um etwa 80%. Alternative Zuckersubstrate konnten dagegen nicht umgesetzt werden. Die biochemischen Unterschiede zwischen den UGD-Isoformen und die differentielle Expression ihrer entsprechenden Genekönnten eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellwandbiosynthese spielen. Denn die irreversible Oxidation von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure durch UGD fungiert als eine der Schaltstellen, an welcher der Kohlenstofffluss derpflanzlichen Zelle in Richtung Zellwandbiosynthese gesteuert werden kann. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen von Einfach-oder Doppel-knock out-Mutanten, bei denen durch eine T-DNA-Insertion ein oder zwei UGD-Gene ausgeschaltet waren, zeigte dementsprechend auch eine veränderte Zellwandzusammensetzung bei den Mutanten deltaUGD2, deltaUGD3 und deltaUGD1x deltaUGD4 und eine veränderte Funktion der Stomata bei deltaUGD1x deltaUGD4. Insgesamt waren die Phänotypänderungen gegenüber dem Wildtyp bei der Doppelmutante deltaUGD1x deltaUGD4 wesentlich ausgeprägter als bei den Einfachmutanten, was daran liegen könnte, dass der Ausfall eines UGD-Gens durch ein anderes kompensiert wird. Dafür sprechen auch die Ergebnisse der real time-PCR-Analyse, in der die Expression von UGD1, 2, 3 und 4 in sechs Tage alten Keimlingen des Wildtyps und der knock out-Mutanten untersucht wurde. Dort konnte nachgewiesen werden, dass sich das Ausschalten eines oder mehrerer UGD-Gene auf die Expression der übrigen UGD-Gene auswirkt.The cell wall of Arabidopsis thaliana contains a large amount of hemicelluloses and pectins, which are basically composed of nucleotid-sugars synthesized via the common precursor UDP-glucuronic acid. In plants, UDP-glucuronic acid is predominantly synthesised via UDP-glucose dehydrogenase (UGD), which catalyses the oxidation of UDP-glucose to UDP-glucuronic acid by the formation of two NADH molecules. Furthermore, UGD acts as a key enzyme to channel carbohydrates into the pool of UDP-sugars used for cell wall biosynthesis. In Arabidopsis thaliana, four genes and one pseudogene coding for UGD were identified that show strong homologues to other plant UDP-glucose dehydrogenases. In my present thesis I demonstrated by the use of promotor::GUS reporter gene plants and real time PCR, that all four UGD genes were expressed tissue-specific. Moreover, during plant development all UGD genes were highly variable in their expression levels. Furthermore, every stage of morphogenesis is correlated with the expression of at least one UGD gene. The biochemical characterization of the different isoforms revealed similar Km-values (approximately 43µM) for the cofactor NAD+ but Km-values across a broad range (123 - 335µM) for the substrate UDP-glucose. All isoforms were feedback inhibited by UDP-xylose. This inhibition was strongly correlated with the affinity for UDP-glucose that was accepted as substrate only. NADP+ could be replaced by NAD+ but decreased the enzyme activity about 80%. All the biochemical differences between the four UGD isoforms in Arabidopsis and their differential gene expression described in my thesis might play a crucial role in the regulation of cell wall biosynthesis. Single or double knock out mutants, in which one or two UGD genes were discarded by T-DNA insertion, showed a modified cell wall composition (mutants: deltaUGD2, deltaUGD3 and deltaUGD1x deltaUGD4) and a modified stomata function (deltaUGD1x deltaUGD4). Phenotypic changes between wild type and mutants were considerably increased for the double mutant deltaUGD1x deltaUGD4 compared to the single mutants. This effect might be explained by a compensation of the knock out gene via the remaining UGD isoforms and is supported by real time PCR analysis which showed that the knock out of one or two UGD genes also affected the expression levels of the remaining ones

Topics: Genexpression, UDP-Glucose-Dehydrogenase, Zellwand, ddc:570
Year: 2010
OAI identifier: oai:publikationen.ub.uni-frankfurt.de:7625

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