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Biochemische und biophysikalische Charakterisierung von intrinsischen und extrinsischen Modulatoren des Antigentransporters TAP

By Gabriele Plewnia

Abstract

Presentation of intracellular processed antigens by major histocompatibility (MHC) class I molecules to CD8+ cytotoxic T lymphocytes is mediated by the macromolecular peptide loading complex (PLC). In particular accessory proteins, including the transporter associated with antigen processing (TAP) and tapasin, play a pivotal role in the MHC class I mediated antigen presentation pathway. TAP belongs to the ATP-binding cassette (ABC) superfamily and consists of TAP1 (ABCB2) and TAP2 (ABCB3), each of which possesses a transmembrane and a nucleotide-binding domain (NBD). The ER-resident glycoprotein tapasin promotes the optimal folding and assembly of MHC-peptide complexes, and independently stabilizes the steady state expression level of TAP. In the present thesis recombinant Fv, scFv and Fab antibody fragments to human TAP from a hybridoma cell line expressing the TAP1-specific monoclonal antibody mAb148.3, were generated. The epitope of the mAb148.3 was mapped to the very last five C-terminal amino acid residues of TAP1 on solid-supported peptide arrays. The recombinant antibody fragments were heterologously expressed in E. coli and insect cells, and purified to homogeneity by affinity chromatography. The monoclonal and recombinant antibodies display nanomolar affinity to the last five C-terminal amino acid residues of TAP1 as demonstrated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR). Surprisingly, the recombinant antibody fragments confer thermal stability to the heterodimeric TAP complex in insect cells when incubated at elevated temperature. At the same time, TAP is arrested in a peptide transport incompetent conformation, although ATP and peptide binding to TAP are not affected. Furthermore, the recombinant antibodies were successfully used in the purification of the PLC from a human B-lymphoblastoid cell line and a novel factor, protein disulfide isomerase (PDI), was identified by matrix assisted laser desorption/ionisation-mass spectrometry (MALDI-MS). In the second part of this thesis the tapasin-MHC class I interaction was investigated. It is for this reason, that an in vitro assay had been established for direct measuring tapasin-MHC class I interactions. First, soluble single chain MHC class I molecules were engineered, choosing two MHC class I alleles: HLA-B4402 representing a highly tapasin-dependent allele and with HLA-B4405, a tapasin-independent allele was chosen. Tapasin as well as the two single chain MHC class I constructs, scB4402-b2m and scB4405-b2m, were expressed in insect cells and purified from insect cell supernatants by affinity chromatography. In contrast to the HLA-B4405 allele, which was expressed and secreted at moderate yield, the HLA-B4402 allele was expressed and trapped inside the insect cells instead of secreted into the medium. Peptide-binding and anisotropy measurements with fluorescein-labeled peptides verified the functionality of the scB4405-b2m. For further investigation of the tapasin-MHC class I interaction an in vitro assay was established using surface plasmon resonance spectroscopy. Due to the transient nature of the interaction including the decreased affinity of both interaction partners, kinetic data acquisition was difficult to evaluate. Furthermore, interaction of the scB4405-b2m with the sensor surface itself contributed to the measured interaction. Additionally, to investigate tapasin editing function, tapasin as well as the scB4405-b2m-peptide complex were tethered on fluid chelator lipid bilayers and monitored by reflectance interference (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Stable immobilization of scB4405-b2m-peptide complex as well as of tapasin was observed, unfortunately no changes in peptide dissociation kinetics monitored in the TIRFS channel were detected. Presumably, the tapasin-independent HLA-B4405 already loaded with a high affinity peptide is not influenced by the peptide-editing function of tapasin. Here, for the first time an in vitro assay was established for direct probing interactions within the various proteins of the PLC.MHC (major histocompatibility complex class)-Klasse I-Moleküle präsentieren den CD8+ T-Lymphozyten intrazellulär prozessierte Antigene. Die Präsentation wird durch den makromolekularen Peptidbeladungskomplex (PLC) vermittelt. Dabei spielen das Glykoprotein Tapasin als auch TAP (transporter associated with antigen processing) eine essentielle Rolle in der Peptidbeladung der MHC-Klasse I-Moleküle. Die durch das Proteasom produzierten Peptide werden von TAP aus dem Zytoplasma in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert. Anschließend werden diese Peptide auf MHC-Klasse I-Moleküle geladen und über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert. Dabei spielt das ER-ständige Glykoprotein Tapasin eine wichtige Rolle: Tapasin fördert die optimale Faltung und Assemblierung der MHC-Klasse I-Peptid-Komplexe. Außerdem reguliert Tapasin das Expressionsniveau von TAP, indem es diesen stabilisiert. Sowohl die strukturelle Organisation des PLCs, einschließlich des antigenen TAPKomplexes, als auch die Funktion von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen ist Gegenstand intensiver Forschung. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Fv, scFv und Fab Antikörperfragmente ausgehend von einer Hybridomzelllinie, die einen TAP1-spezifischen monoklonalen Antikörper mAb148.3 exprimiert, generiert. Wie bereits durch Epitopkartierung identifiziert, besteht das Epitop aus den letzten fünf C-terminalen Aminosäuren von TAP1. Die rekombinanten Antikörper wurden zunächst heterolog in E. coli sowie in Insektenzellen exprimiert und mittels Affinitätschromatographie zur Homogenität gereinigt. Sowohl der monoklonale als auch die rekombinanten Antikörper zeigen eine Affinität im nanomolaren Bereich bezüglich der letzten fünf C-terminalen Aminosäuren von TAP1 wie in enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) und mittels Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie (SPR) gezeigt. Überraschenderweise stabilisieren die rekombinanten Antikörper den heterodimeren TAP-Komplex bei erhöhter Temperatur. Gleichzeitig wird, in Anwesenheit der rekombinanten Antkörper, die Peptid-Translokation durch TAP drastisch inhibiert. Dabei wird die ATP- und Peptid-Bindung an TAP nicht beeinträchtigt. Die rekombinanten Antikörper wurden ebenfalls bei der Reinigung des Peptidbeladungskomplexes aus einer humanen Blymphoblastoiden Zelllinie erfolgreich angewendet. Hierbei konnte mittels Matrix-assistierter Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) eine neue Komponente des PLCs, die Proteindisulfidisomerase (PDI), identifiziert werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems für die Untersuchung der Tapasin-MHC-Klasse I-Interaktion. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalen, löslichen single chain MHC-Klasse I-Molekülen aus Insektenzellen aufgestellt. Neben einem tapasin-abhängigem MHC-Klasse I-Allel, HLA-B4402, wurde auch ein tapasin-unabhängiges HLA-B4405 als single chain Konstrukt generiert. Im Gegensatz zu dem tapasin-abhängigem scB4402-b2m, wurde das tapasinunabhängige scB4405-b2m ins Medium sezerniert und konnte zur Homogenität gereinigt werden. In Peptid-Bindungsstudien, sowie in Anisotropie-Messungen wurde die Funktionalität des scB4405-b2m nachgewiesen. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und scB4405-b2m-Molekülen konnte mittels SPR eine direkte Interaktion nachgewiesen werden, wobei Hintergrund-Interaktion der scB4405-b2m mit der Sensor-Oberfläche und die transiente, niederaffine Interaktion eine kinetische Auswertung schwierig machten. Um detaillierte Untersuchungen zur Rolle von Tapasin als Peptid-Editor durchzuführen, wurden Tapasin und scB4405-b2m-Peptid-Komplexe auf einer Chelator-Lipid-Oberfläche co-immobilisiert. Die Verwendung einer Lipid-Doppelschicht ermöglichte laterale Mobilität. Mittels TIRFS (Totalinterne Reflektions-Fluoreszenz-Spektroskopie) wurde nun der Einfluß von Tapasin auf die Peptid-Dissoziation beobachtet. Dabei stellte sich heraus, dass die Peptid-Dissoziation des tapasin-unabhängigen scB4405-b2m in An- bzw. Abwesenheit von Tapasin unverändert blieb. Mit dem in dieser Arbeit etablierten in vitro Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Funktion von Tapasin, sowie weiteren Chaperonen des Peptidbeladungskomplexes wie z.B. ERp57 bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen

Topics: ABC-Transporter, Monoklonaler Antikörper, ddc:570
Year: 2009
OAI identifier: oai:publikationen.ub.uni-frankfurt.de:6217

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Citations

  1. (1995). Calnexin recognizes carbohydrate and protein determinants of class I major histocompatibility complex molecules.
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  3. (2006). Functions of ERp57 in the folding and assembly of major histocompatibility complex class I molecules.
  4. (2004). Natural HLA class I polymorphism controls the pathway of antigen presentation and susceptibility to viral evasion.
  5. (1998). Structural principles that govern the peptide-binding motifs of class I MHC molecules.
  6. (2003). Tapasin is a facilitator, not an editor, of class I MHC peptide binding.

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