REGULACION DE LA DINAMICA Y METABOLISMO MITOCONDRIAL POR INCRETINA GLP-1 EN CELULAS DE LA LINEA A7R5

Abstract

El péptido similar a glucagón-1 (GLP-1) es una incretina secretada por las células intestinales. Su acción clásica es regular la respuesta secretoria de insulina por el páncreas. Sin embargo, recientemente se ha descrito que GLP-1 posee acciones extrapancreáticas muy similares a la insulina, con mecanismos de señalización tejido-específicos. Por sus muchas acciones fisiológicas, y la mayoría relacionadas con los efectos insulinotrópicos de esta incretina, derivados peptidomiméticos de GLP-1 se utilizan actualmente para controlar la hiperglicemia en individuos con diabetes mellitus tipo 2. Debido a esto se hace muy interesante investigar su acción específica sobre distintos tipos celulares que sufren alteraciones en patologías relacionadas con alteraciones metabólicas asociadas a la diabetes mellitus. En particular, se hace muy interesante estudiar el efecto de GLP-1 sobre las células vasculares musculares lisas (VSMC). Estas células responden a variadas señales ambientales fisiopatológicas o bioquímicas, regulando su función y su fenotipo. Sin embargo, aún no se comprende la totalidad de mecanismos involucrados en los cambios fenotípicos que ocurren en estas células en patologías como la diabetes. Evidencias recientes han involucrado a las alteraciones metabólicas que sufren las VSMC con la mayor incidencia de aterosclerosis en pacientes diabéticos. Las mitocondrias son los principales organelos asociados con el control del metabolismo energético dentro de una célula. Actualmente, se sabe que procesos subcelulares tales como la interacción mitocondria-retículo endoplásmico y los fenómenos de fusión y fisión mitocondrial, conocido como dinámica mitocondrial, son capaces de regular la función y el metabolismo mitocondrial. La dinámica mitocondrial está finamente regulada por las proteínas Mitofusinas 1/2 y OPA-1 para el caso del proceso de fusión, y Drp-1 y Fis-1 para el caso del proceso de fisión mitocondrial. Se ha descrito un papel trascendental para la proteína Drp-1 en la regulación del proceso de fisión, ya que puede sufrir modificaciones postraduccionales que modulan su interacción con la mitocondria generando cambios en el proceso de fisión. Dentro de las modificaciones postraduccionales de Drp-1 se destaca una fosforilación inhibitoria por PKA. Debido a que el receptor clásico de GLP-1 es una proteína de siete dominios de transmembrana acoplada a proteína Gs, la activación por GLP-1 de este receptor aumentaría los niveles intracelulares de cAMP activando PKA, pudiendo regular potencialmente el proceso de fisión mitocondrial vía Drp-1. Esta regulación podría ser un nuevo mecanismo por el cual GLP-1 podría regular, vía el control de la dinámica, el metabolismo mitocondrial y por ende el metabolismo celular. Con todos estos antecedentes se propuso como hipótesis que GLP 1 inhibe el proceso de fisión mitocondrial, incrementando el metabolismo mitocondrial a través de la fosforilación de Drp 1, en células de la línea A7r5. Para probar esta hipótesis, células A7r5 correspondientes a células embrionarias de VSMC de aorta de rata se trataron con GLP-1 (100 nM) por O- 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Orange en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microscopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número, volumen promedio y área promedio de las mitocondrias. Los resultados muestran que GLP-1 inhibió el proceso de fisión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen y el área mitocondrial promedio. Además, en estas condiciones, los niveles de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles, descartando que GLP-1 induzca biogénesis mitocondrial. El metabolismo mitocondrial se evaluó mediante la determinación de potencial de membrana mitocondrial, usando la sonda JC1; producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), usando la sonda dihidrocloro fluoresceína; niveles intracelulares de ATP, usando lucifenina/luciferasa; y tasa de respiración, medido por oxigrafía. GLP-1 (100 nM) aumentó el potencial de la membrana mitocondrial, los niveles de ROS, los niveles intracelulares de ATP y el consumo de oxígeno. Se demostró que en células A7r5, GLP-1 activa a la vía transduccional dependiente de PKA. Además, mediante inmunoprecipitación de Drp-1 y posterior detección de la fosforilación de Drp-1 por Western blot se determinó que GLP-1 induce la fosforilación de Drp-1 de una manera similar a la inducida por forskolina. Además, mediante inmunofluorecencia se observó que GLP-1 previene la translocación de Drp-1 a la mitocondria. Utilizando H-89, un inhibidor específico de PKA, se demostró que la inhibición del proceso de fisión mitocondrial es dependiente de la activación de PKA. Posteriormente, se analizó la dependencia de la vía PKA para la acción de GLP-1 sobre el metabolismo mitocondrial. H-89 revertió el efecto de GLP-1 sobre el potencial de membrana mitocondrial y el incremento de los niveles de ROS. En resumen, los datos obtenidos permite sugerir que GLP-1 aumenta el metabolismo mitocondrial en las células A7r5 por un mecanismo que involucra la inhibición del proceso de fisión mitocondrial y la fosforilación de Drp-1 a través de una vía transduccional dependiente de PKA

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