SEÑALES DE CALCIO NUCLEAR INDUCIDAS POR IGF-1 EN CARDIOMIOCITOS: CARACTERIZACION Y MECANISMO FUNCIONAL

Abstract

IGF-1 es un importante estímulo pro hipertrófico y antiapoptótico en los cardiomiocitos. Diversas vías de transducción de señales son activadas por IGF-1 en los cardiomiocitos y están involucradas sus efectos fisiopatológicos. En nuestro laboratorio hemos estudiado la participación del calcio intracelular en el sistema transduccional del IGF-1. Encontramos que IGF-1 incrementa los niveles intracelulares de calcio de modo transitorio y con una cinética rápida a nivel de los núcleos celulares. Este efecto fue mediado por proteína G heterotrimérica. PLC IP3 y sus receptores. En el presente trabajo profundizamos en el mecanismo involucrado en este fenómeno. Las poblaciones mononucleadas y binucleadas de los cardiomiocitos se distribuyeron en una proporción 3:1, presentando ambos tipos celulares una morfología nuclear equivalente y una respuesta del calcio nuclear comparable al estimular con IGF- 1. Utilizando la proteína buffer de calcio parvalbumina (PV) destinada al núcleo (NLS) o al citosol (NES), estudiamos la contribución de ambos compartimentos en la regulación del calcio intracelular por IGF-1. Las proteínas de fusión se localizaron en el compartimento subcelular esperado, modulando específicamente el calcio en cada compartimento. La expresión de PV-NLS bloqueó completamente los aumentos de calcio en el núcleo y el citosol, mientras que PV-NES inhibió solo el aumento de calcio citosólico, sin afectar el nuclear, sugiriendo un componente de liberación de calcio nuclear al estimular con lGF-1. Además, PV-NLS (pero no PV-NES) inhibió el aumento de la actividad del reportero MEF-2c induc ido por IGF-1 Luego estudiamos la localización del IGF-1R en los cardiomiocitos. iGF-1Rα. se localizó predominantemente en el núcleo celular y la zona perinuclear, colocalizando con marcadores nucleares específicos. En células fijadas, IGF-1Rα se localizó en la zona perinuclear, sugiriendo una topo logía asociada a los núcleos celulares. Por otro lado IGF-lRβ, fue detectado en la zona pe rinuclear y colocalizó con marcadores específicos nucleares. Tanto IGF-lα como IGF-IRβ colocalizaron en la región perinuclear y además fueron detectados en fracciones purificadas de proteínas nucleares y de proteínas de membrana, pero no en la fracción de proteínas citosólicas. Luego estudiamos la estructura de la membrana plasmática utilizando compuestos fluorescentes específicos. Encontramos que la membrana plasmática presenta estructuras en forma de in vaginaciones en las zonas cercanas a los núcleos celulares. α1c-LTCC, marcador específico de los túbulos T, se localizó de modo impo11ante en la zona perinuclear y el núcleo, y además colocalizó con IGF-lRα. La alteración estructural de los túbulos-T modificó las características cinéticas de las oscilaciones basales de calcio y además inhibió completamente el efecto del IGF-1 sobre el calcio. Caveolina-3, marcador específico de caveolas, se localizó abundantemente en la zona nuclear y perinuclear, y además colocalizó parcialmente con IGF-lRα. La desestructuración de los lipidsrafts utilizando MCD, retardó la cinética de los aumentos de calcio intracelular y la fosforilación de CREB inducidos por IGF-1. En conjunto, estos resultados sugieren que el complejo IGF-1R involucrado en la regulación del calcio nuclear se encuentra presente en estructuras particulares de la membrana plasmática (aparentemente túbulos-T) que se organjzan en la región nuclear y perinuclear de los cardiomiocitos. Posteriormente analizamos el mecanismo funcional involucrado en los aumentos del calcio nuclear activados por el complejo nuclear IGF- 1R/proteína Gi. IGF-lRβ basalmente colocalizó con proteína Gαi en la zona perinuclear. Mediante inmunoprecipitación del IGF-1Rβ, encontramos que éste se asocia basal mente tanto con la proteína Gαi y como con dímero Gβ. La estimulación con IGF-1 incremento la asociación entre estas proteínas sugiriendo un reclutamiento de la proteína Gi heterotrimérica al estimular con IGF-l. Luego, estudiamos la localización subcelular de las dos principales isoformas de PLC presentes en los cardiomiocitos, PLCβ3 y PLCy. PLCβ3 fue observada principalmente en la zona perinuclear y el núcleo, y colocalizó con el marcador nuclear LAP-2. Por otro lado, PLCy se localizó con un patrón estriado, que colocalizó con el marcador de bandas Z α-actinina y además se detectó abundante localización perinuclear de PLC-y. La activación de PLCy fue estudiada analizando su fosforilación. Encontramos un aumento rápido (máximo 30 segundos) y transitorio (5 minutos) de la fosforilación de PLCy. Ésta ocurrió principalmente en la zona perinuclear, sugiriendo que IGF-1 activa PLCy predominantemente en la zona perinuclear. La activación de PLCβ3 fue estudiada indirectamente cuantificando los ni veles de IP3 en células adenoviralmente transducidas con el péptidos βARKct, que bloquea la señalización dependiente de Gβy (principal responsable de la activación de PLCβ3). Los aumentos de los niveles de IP3 inducidos por IGF-1 fueron totalmente bloqueados en células transducidas con βARKct, indicando que IGF-1 activa PLCβ (i.e. PLCβ3) mediante Gβy. Posterionnente, expresamos proteínas fluorescentes que reconocen y unen específicamente a estos fosfolípidos de membrana plasmática. Encontramos que éstos se localizan abundantemente en la región perinuclear y el núcleo. Adicionalmente, utilizamos una proteína reportera que reconoce específicamente PIP2, el sustrato de PLC, y analizamos los cambios en su localización al estimular con IGF-1. Éste, rápidamente disminuyó la fluorescencia perinuclear de la proteína reportera, sugiriendo que la hidrólisis de PIP2 al estimular con IGF-1 ocurre preferentemente en esta zona. La contribución de PLCβ3 y PLCy en la activación de los aumentos del calcio nuclear al estimular con IGF-1 fueron analizados en cardiomiocitos permeabilizados e incubados con anticuerpos específicos dirigidos contra cada una de las isofonnas. Tanto el anticuerpo contra PLCβ3 como el contra PLCy modificaron la cinética de la señal de calcio, mientras que la permeabilización por si sola o un anticuerpo inespecífico no tuvieron efecto. Estos resultados sugieren que IGF-1 activa isoformas nucleares de PLC que están involucradas en la regulación del calcio nuclear. En conjunto los resultados de la presente tes is sugieren que en los cardiomiocitos, IGF-1 regula un componente de liberación de calcio nuclear y que el sistema transduccional del IGF-1 se localiza en la zona perinuclear en estructuras particulares de la membrana plasmática que allí se organizan. Estas estructuras aparentemente conesponden a túbulos T y la integridad de estas estructuras sería necesaria para los efectos del IGF-1 sobre el calcio nuclear. Este efecto involucra la activación de isoformas nucleares de PLC con participación de proteína G. Estos eventos finalmente estarían asociados a la activación de ciertos factores transcripcionales importantes en la señalización del IGF-1 en los cardiomiocitos

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