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Recruitment of PyK2 during complement mediated phagocytosis and expression of kinase domains in insect cell

By Carina Dinis Santos

Abstract

Tese de mestrado em Química Inorgânica Biomédica (Aplicações em Diagnóstico e Terapia), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011In all human beings, when a pathogen enters the body, specialized cells are recruited to the site of inflammation, where, by different pathways and with the help of different macromolecules, they will destroy the invading microorganism. Past and ongoing research in this field is directed toward understanding the molecular and cellular regulation of this process. One way to destroy pathogens is the phagocytosis and subsequent intracellular killing, where macrophages play an important role, both by recognizing these pathogens and ingest them. To recognize pathogens, the macrophages have different receptors on their surface, for example Fc receptors (FcR) and complement receptors (CR), which bind to immunoglobuline G (IgG) or complement factor 3b (C3b) opsonized particles, respectively. After the macrophages have recognized a pathogen, several signalling processes regulate the uptake of the bacteria by the phagocytes. For example, non-receptor tyrosine kinases may be recruited to the plasma membrane, where they transmit signaling by cell surface receptors, controlling processes as diverse as the immune response, cell adhesion and neuronal cell migration. One member of this group of proteins is Pyk2, which can be involved in cell growth, shape and tumor invasion. In this study it is demonstrated that Pyk2 is recruited to the site of uptake, when a C3b-opsonized particle is recognized by the CRs on mouse macrophages. Specificity of the Pyk2 antibody, used for this study, was assured by in vitro assays. When a mouse-specific CD11b antibody was used to block the complement receptor 3, the uptake and internalization of particles opsonized with complement, but not of particles opsonized with IgG, decreased significantly, proving that these particles were phagocytosed by the complement receptors. The functional role of Pyk2 in this issue has to be determined in further studies. Taken together, these results could improve the understanding of complement receptor mediated phagocytosis. In a second approach, the Baculovirus expression was used to express functional human protein kinases in insect cells. Thus, different recombinant proteins were produced and purified, such as the Glutathione-S-Transferase (GST)-mFRNK-TAT and GST-Hck-kinase domain (KD). A Pyk2-KD and FAK-KD were also expressed by this system, purified, and successfully employed in in vitro kinase assays. Accordingly, this project covered all the steps necessary for the production of recombinant proteins and expression using the Baculovirus expression vector system. As the purified kinase domains showed activity, they will be useful tools for further biochemical in vitro studies.Em todos os seres humanos, quando um agente invasor entra no corpo, células especializadas são recrutadas para o sítio de inflamação onde, por diferentes vias e com a ajuda de diferentes macromoléculas, vão destrui-lo. Investigações nesta área são maioritariamente direccionadas para o entendimento da regulação molecular e celular deste processo. A fagocitose, processo pelo qual as partículas invasoras maiores que 0.5 μm de diâmetro são destruídas pelas células especializadas, tem um papel importante na imunidade inata, tanto por facilitar a remoção destas partículas como por iniciar a resposta imune adaptativa. É uma função fisiológica essencial, comum à maioria dos tipos de células eucarióticas e envolve a activação de complexas redes de sinalização. Como efetores críticos do sistema imunitário, os macrófagos usam processos de sinalização durante a adesão para concretizar muitas funções celulares essenciais, inclusivamente a fagocitose. Numerosos receptores fagocíticos estão presentes nos macrófagos, que se ligam directa ou indirectamente ao alvo. Destes receptores, os Fcγ e CRs são os mais estudados e exibem mecanismos diferentes de fagocitose e respostas celulares subsequentes que reflectem diferenças importantes nas suas vias de sinalização. Os Fc receptores (FcRs) servem de mediadores da fagocitose de partículas opsonizadas por IgG e os receptores de complemento (CRs) reconhecem as partículas opsonizadas com C3b/C3bi, componentes presentes no soro. Estes receptores juntam-se normalmente à volta da presa e induzem cascadas de sinalização intracelular que levam à activação e recrutamento de moléculas adaptadoras e de sinalização para sítios de ligação de partículas. A interacção das partículas opsonizadas com o complemento com CR3, desencadeia a imersão das partículas opsonizadas com o complemento e desempenha um papel importante na adesão celular, assim como na fagocitose. O papel da Pyk2, uma Proteína Tirosina Quinase não receptora, nas células da imunidade inata ainda não é claro. A Pyk2 não abriga os domínios SH2 ou SH3, mas contém vários sítios de ligação para diferentes proteínas de sinalização contendo SH2/SH3. Após a activação/autofosforilação dessa enzima em Tyr402, a Pyk2 pode ligar-se a proteínas do citoesqueleto (como a paxilina), de ligação (como a p130Cas), ou outras tirosina quinases (incluindo membros da família Src), que podem potencialmente impingir a Pyk2 numa variedade de vias de transdução de sinal. O sítio de autofosforilação da Pyk2 serve como um local de encaixe para o domínio SH2 da Src, permitindo-lhe alcançar uma conformação activa. Seguindo a activação, tanto a quinase Pyk2 como a Src funcionam em conjunto para activar a jusante moléculas de sinalização. Tem sido demonstrado que, juntamente com Src, a Pyk2 funciona como um elo entre receptores acoplados à proteína G heterotrimérica e a via de sinalização da proteína quinase activada por mitógeno (MAP). Estudos anteriores mostraram que esta proteína é importante na activação dos macrófagos. Esta proteína foi mostrada ser uma molécula de sinalização intracelular crítica, integrando a estimulação de receptores de quemoquina e de factores de crescimento com várias vias a jusante. Anteriormente, a Pyk2 tem sido associada a processos de migração e adesão, através de sua activação em resposta a diferentes quemoquinas e integrinas. Foram produzidos ratos deficientes em Pyk2 e a sua análise mostra que se desenvolvem normalmente, excepto por exibirem migração de macrófagos com defeito. Além disso, a Pyk2, tal como a FAK, podem ser reguladas pela activação de receptores de integrina. No entanto, a Pyk2 não está localizada em contactos focais, mas sim concentrada na região perinuclear das células. Neste contexto, foi então estudado se esta proteína, presente em diferentes processos de sinalização, era recrutada durante a fagocitose mediada por receptores complemento. Para os receptores complemento presentes nos macrófagos reconhecerem as partículas acopladas com IgM, e activarem a fagocitose, estas partículas foram incubadas com soro de ratos, opsonizando deste modo as partículas com o factor C3b, que é reconhecido pelos receptores complemento. Foram usadas para este estudo partículas acopladas com Albumina e GST, que não devem ser reconhecidos por nenhum receptor, IgG que é reconhecida por receptores Fcγ mas não CRs, IgM que sem incubação com soro não é reconhecida por nenhum receptor e depois de incubação com soro é reconhecida pelos CRs e iC3b, um factor do complemento que é directamente reconhecido pelos CRs. Depois de testado, o anticorpo usado para a detecção da Pyk2 nas células foi considerado específico para a proteína, provando que todo o sinal detectado pelo mesmo se devia à Pyk2. Foram também realizados testes para a optimização do processo de infecção e coloração das células, assim como para o processo de fagocitose. Também foi provado que as partículas eram de facto fagocitadas pelos macrófagos, já que foram detectados fortes sinais depois de coloração com actina, já demonstrada ser necessária ao processo de fagocitose. O estudo iniciou-se com ensaios intra e extracelulares, para quantificar a percentagem de internalização e adesão das partículas às células. Foi provada a internalização das partículas acopladas com IgM e incubadas posteriormente com soro pelos receptores complemento, usando um anticorpo de CD11b M1/7015. Este anticorpo foi estudado anteriormente e foi demonstrado por bloquear os receptores complemento. Ao usar este anticorpo antes da infecção, as partículas deixaram de ser internalizadas. Foi investigado então o recrutamento da Pyk2 durante a fagocitose mediada por receptores complemento e foi detectado um claro sinal, provando a participação desta proteína neste processo. Foi também detectado aumento da autofosforilação desta proteína em células lisadas, depois de infecção com IgG e IgM mais soro. Num outro projecto, a Expressão por Baculovírus foi usada para a expressão e produção de proteínas funcionais. O Sistema de Expressão por Baculovírus usando vectores (BEVS) é o sistema de expressão eucariótica mais poderoso e versátil disponível. Neste sistema, vários genes Baculovírus não essenciais ao ciclo de vida na cultura de tecidos podem ser substituídos por genes heterólogos. Já que o genoma Baculovírus é geralmente muito grande para facilmente inserir genes estranhos, genes heterólogos são clonados em vectores de transferência. A co-infecção do vector de transferência e do DNA AcNPV dentro de células Spodoptera frugiperda (Sf) proporciona a recombinação entre os sítios homólogos, transferindo o gene heterólogo do vector de transferência para o DNA AcNPV. O Vírus de Poliedrose Nuclear Autographa californica (AcNPV) é o tipo de Baculovírus mais extensivamente estudada. A infecção de células Sf com o AcNPV resulta na paragem da expressão dos genes do hospedeiro, o que permite uma elevada taxa de produção de mRNA recombinante e de proteína. O vírus recombinante induz a expressão da proteína alvo recombinante e também infecta as células de insecto adicionais, resultando em vírus recombinantes adicionais. Para a expressão da GST-Hck-KD e GST-mFRNK-TAT, o cDNA da GST foi primeiro clonado num vector de transferência, pVL1392. Depois de obtido o novo vector de transferência, o cDNA da Hk-KD e mFRNK-TAT foi clonado nesse novo vector, pVL1392 N-term GST. Todas as construções foram sequenciadas e analisadas. As células Sf9 foram então co-infectadas com os vectores finais e o DNA BaculoGoldTM, levando à produção de Baculovírus recombinantes e expressão das proteínas heterólogas. O vírus recombinante foi amplificado por vários ciclos até o título do vírus ser maior ou igual a 2x108 pfu/mL e o título foi determinado indirectamente por coloração e subsequente análise por microscopia florescente. O mesmo foi então expresso, durante um tempo determinado por western blot, as células lisadas e as proteínas purificadas por FPLC. Depois de obtida a proteína, foi feita uma diálise de aproximadamente 18 horas e a concentração determinada por um gel SDS. Para determinar se as proteínas quinase eram activas, foram realizados ensaios de quinase in vitro. Foram testadas duas proteínas expressas, que demonstraram ser activas

Topics: PyK2, Fagocitose, Receptores complemento, Expressão por Baculovirus, Proteinas recombinantes, Teses de mestrado - 2011
Year: 2011
OAI identifier: oai:repositorio.ul.pt:10451/8002

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