The Tat pathway in Listeria monocytogenes

Abstract

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Listeria monocytogenes, a foodborne pathogenic bacterium, remains a serious public health concern due to its frequent occurrence in food products coupled with a high mortality rate, specially among immunocompromised hosts. Bacterial pathogenicity depends greatly on the ability to secrete virulence factors to or beyond the bacterial cell surface. Thus, the study of secreted proteins is of crucial importance to further develop defensive strategies. The Tat pathway, one of the secretion systems present in L. monocytogenes, was until now only investigated in silico. Therefore, a better understanding of the Tat pathway was needed. In L. monocytogenes, strain EGDe, two proteins constitute the Tat pathway and are encoded in the genes tatC (lmo0361) and tatA (lmo0362). In the present study, a L. monocytogenes mutant strain lacking the genes coding for the Tat pathway was successfully constructed (EGDe ΔtatAC). The mutant showed the ability to grow at the same growth rate as the parent strain, proving that the Tat pathway is not essential for L. monocytogenes survival. Moreover this study showed that both genes are transcribed in a bicistronic and growth-phase dependent manner. The deletion mutant for the Tat pathway showed no differences in the in vitro virulence potential, but significant differences (p < 0.05) were found when in vivo virulence potential was assessed, being the tat mutant more virulent than the wild-type strain. Regulation of tatAC was also investigated, and a deletion mutant for lmo0364, a gene coding for a transcription regulator, localized close to the tat genes, was constructed. Our results show that Lmo0364 is not related to the other genes in the locus, as it is not involved in the transcription regulation of any of the genes analyzed. This is, to our knowledge, the first experimental study on the Tat pathway of L. monocytogenes. Here we show that this pathway is not essential for the bacterium and that it might be impairing its virulence ability.Listeria monocytogenes é actualmente considerada uma bactéria patogénica de risco para a Indústria Alimentar, afectando essencialmente grávidas, crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos. Este risco torna-se cada vez mais importante, à medida que aumentam os casos de doentes imunocomprometidos, quer por infecções por VIH ou por tratamentos como quimioterapia e radioterapia, entre outros. L. monocytogenes é uma bactéria gram-positiva em forma de bastonete com dimensões de 0,4 μm por 1 a 1,5 μm. Esta bactéria caracteriza-se pelo seu baixo teor em G+C, por ser anaeróbia facultativa, catalase positiva e oxidase negativa. A sua principal característica é a sua versatilidade no que diz respeito às condições de crescimento, nomeadamente, temperatura (1 a 45 ˚C), pH (4,4 a 9,6), cloreto de sódio (10 a 20% (m/v)), sais biliares (10 a 40% (m/v)), actividade da água (aw) (≥0,92) e a tolerância a alguns metais, geralmente tóxicos para outras bactérias, como o lítio, o tálio e o telúrio. Listeriose é o nome dado à doença provocada por L. monocytogenes e encontra-se associada uma elevada taxa de mortalidade (20 a 30%). Na Europa, o número de casos confirmados aumentou 19% em 2009, comparativamente com 2008. L. monocytogenes é um parasita intracelular facultativo. Após ingestão de alimentos contaminados, a bactéria tem a capacidade de atravessar o epitélio intestinal e disseminar-se através dos vasos linfáticos ou sanguíneos, para tecidos mais profundos. O fígado e o baço são órgãos-alvo primários para a sucessiva multiplicação bacteriana, com a possível formação de abcessos. Uma das principais características fisiopatológicas de L. monocytogenes é a capacidade de atravessar barreiras epiteliais, como a barreira hemato-encefálica e a barreira placentária, levando a meningo-encefalite ou infecção do feto, podendo eventualmente causar aborto e morte ou meningite neonatal. A patogenicidade bacteriana encontra-se bastante dependente da capacidade das bactérias segregarem factores de virulência, que são expostos à superfície da célula, segregados para o ambiente extracelular ou, até mesmo, injectados directamente nas células hospedeiras. Enquanto que em bactérias gram-negativas, para que haja secreção de proteínas para o exterior da célula têm de ser transpostas duas membranas biológicas, em bactérias gram-positivas, os mecanismos de transposição da membrana citoplasmática permitem a segregação eficaz de proteínas para o exterior da célula. Em bactérias gram-positivas, são, actualmente, reconhecidos sete sistemas de secreção: Sec (Secretion), Tat (Twin-arginine translocation), FPE (Fimbrilin – Protein Exporter), transportadores ABC (ATP-binding cassette), FEA (Flagella Export Apparatus), Holinas e Sistema Wss. Relativamente a L. monocytogenes, embora a secreção de proteínas seja de extrema importância, quer no processo de colonização de ambientes bióticos e abióticos, quer na sua virulência, ainda muito pouco é conhecido. Assim, a partir dos genomas sequenciados e com recurso à bioinformática, foram indentificados, em L. monocytogenes, todos os sistemas descritos para gram-positivos. O sistema Tat é responsável pela secreção de proteínas na sua conformação final, tendo as proteínas secretadas por este sistema um motivo N-terminal [(S/T)TRRXFLK] de consenso. Este sistema de secreção foi primeiramente identificado em bactérias gram-negativas, sendo essencial para a sua funcionalidade três proteínas membranares: TatA, TatB e TatC. A maioria das bactérias gram-positivas possui um sistema Tat “minimalista” pois apenas as proteínas TatA e TatC estão presentes, sendo TatA bifuncional, colmatando a inexistência de TatB. Este sistema de secreção está presente em vários microrganismos patogénicos, para os quais foi demonstrada a sua importância para os estilos de vida, saprófito ou patogénico. A secreção de proteínas por este sistema demonstrou ser importante para a mobilidade em Escherichia coli O157:H7, para a infecção e para a aquisição de ferro em Pseudomonas aeruginosa, para o crescimento, divisão e formação de biofilme em Legionella pneumophila e para a capacidade infecciosa in vivo de Staphylococcus aureus. Em L. monocytogenes apenas uma cópia dos genes tatA e tatC foi identificada, sendo que a proteína considerada como secretada por este sistema se encontra codificada num operão muito próximo deste locus. O trabalho que aqui se apresenta teve como objectivo o estudo do sistema Tat em L. monocytogenes. Para avaliar o papel deste sistema de secreção, construiu-se um mutante de delecção da estirpe EGDe nos genes codificantes para o sistema Tat. O mutante foi construído usando um sistema de dois passos: um primeiro passo de integração e segundo passo de desintegração do plasmídeo no genoma, através de regiões homólogas às regiões anterior e posterior aos genes. Tanto quanto se sabe, trata-se do primeiro mutante de delecção descrito para o sistema Tat em L. monocytogenes. O sistema Tat não se mostrou essencial ao crescimento de L. monocytogenes em meio completo e em meio mínimo, apresentando o mutante e a estirpe selvagem taxas específicas de crescimento semelhantes. Foram efectuados estudos transcriptionais relativos ao locus do sistema, nomeadamente análises Northern blot e estudos da actividade promotora, fazendo uso do gene codificante para a β-galactosidase, como gene repórter. A transcrição dos genes tatA e tatC revelou-se dependente da fase de crescimento, sendo a transcrição mais evidente na fase exponencial, comparativamente com a fase estacionária. Demonstrou-se ainda que a transcrição dos genes codificantes para o sistema Tat é bicistrónica, apresentando o operão correspondente uma forte actividade promotora. A existência de um regulador de transcrição (Lmo0364) codificado no locus estudado, levou à hipótese de este se encontrar relacionado com a regulação da transcrição do sistema Tat. Esta hipótese foi investigada através da construção de um mutante de delecção neste regulador de transcrição. No entanto, não foram registadas alterações, quer na transcrição, quer na actividade promotora dos genes estudados. Estudos prévios realizados in silico, por outros autores, identificaram apenas uma proteína secretada através deste sistema. Esta proteína está codificada no operão lmo0365-67, sendo a última do operão (lmo0367). De forma a identificar esta e/ou outras proteínas secretadas por este sistema, procedeu-se a uma análise das proteínas secretadas por SDS-PAGE, não tendo sido no entanto possível detectar alterações entre o secretoma do mutante e o secretoma da estirpe selvagem, possivelmente devido às limitações desta metodologia (limites de resolução e detecção). Os potenciais de virulência dos dois mutantes (EGDe ΔtatAC e EGDe Δlmo0364) foram também avaliados in vitro, através da infecção de células epiteliais humanas, e in vivo, através da contagem de bactérias no baço, após três dias de inoculação subcutânea em ratinhos. Apesar de não terem sido identificadas diferenças no potencial virulento in vitro, foram verificadas diferenças significativas (p < 0,05) in vivo, sendo que o mutante tatAC demonstrou um potencial virulento mais elevado do que a estirpe selvagem, demonstrando que a presença deste sistema de secreção nesta estirpe poderá dificultar o processo de infecção. Ao contrário do que se verificou noutros microrganismos patogénicos, o sistema Tat não é necessário à sobrevivência de L. monocytogenes e muito menos à sua capacidade infecciosa. Tanto quanto se sabe, este trabalho constitui o primeiro trabalho experimental realizado em L. monocytogenes, com o objectivo de estudar o sistema de secreção Tat

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This paper was published in Universidade de Lisboa: Repositório.UL.

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