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Interaction between the neuropeptide kyotorphin and a lipid bilayer: a constant-ph molecular dynamics study

By Pedro Rafael da Silva Álvaro Magalhães

Abstract

Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Kyotorphin is an endogenous dipeptide (L-tyrosine-L-arginine) with analgesic properties. It shares some characteristics with opioid peptides, but unlike them, does not bind to opiate receptors, possessing instead a specific receptor, which is yet to be identified. It has been hypothesized that the binding process of kyotorphin to its receptor is influenced by the biological membrane, according to theso-called 'membrane catalysis' model. Another important factor regulating the binding process is the solution pH, since it has been shown that kyotorphin has a strong conformational dependence on pH. We intend to study the effect of pH on the conformational space of kyotorphin in the presence of a biological membrane model. To accomplish this, we employed molecular simulation methods which allow the specification of pH: the so-called constant-pH molecular dynamics methods. Onemajor improvement of the current implementation of the constant-pH molecular dynamics method was the addition of a new module which allows the explicit simulation of membranes. Kyotorphin was simulated in water in the presence and in the absence of a membrane for 100 ns, and within the pH range 2-12.Here, we present the first constant-pH molecular dynamics simulation of a peptide with the explicit inclusion of a lipid membrane, showing that kyotorphin favors the lipid phase, as has been shown experimentally, and that membrane penetration occurs through both amino acid residues. We also found that kyotorphin’s conformational space remains heavily dependent on pH, with few differences being observed between the water and membrane systems. Additionally we have identified some particular cases hitherto unobserved. We have also fitted our peptide to part of the structure of morphine, witnessing an almost perfect overlap, meaning that it should be able to fulfill some of the structural constraints imposed by an opioid-like receptor.A quiotorfina é um dipéptido endógeno com propriedades analgésicas. Foi encontrada pela primeira vez num encéfalo bovino, e desde então foi também isolada a partir de encéfalos de várias espécies, incluindo humanos. O seu efeito analgésico é 4.2 vezes superior ao da Metionina-encefalina, um pentapéptido opióide endógeno. Embora apresente uma actividade opióide, mostrou-se que a quiotorfina não liga aos receptores opióides, o que levou à hipótese de um mecanismo de acção indirecto, através da ligação a um receptor específico. Como ainda não foi identificado o receptor específico, os detalhes do mecanismo de acção da quiotorfina são desconhecidos, tendo sido no entanto sugeridas duas hipóteses: a activação do receptor pela quiotorfina leva à libertação de Met-encefalina, que leva à activação de um receptor opióide-_; ou a quiotorfina é degradada rapidamente e a L-argininaformada é utilizada pelo enzima NO sintase que leva à formação de NO, que por sua vez induz alibertação de Met-encefalina. A quiotorfina foi classificada como neuropéptido devido a vários motivos: (i) pode ser formada a partir da biossíntese dos aminoácidos tirosina e arginina ou pelo processamento enzimático de proteínas precursoras; (ii) é degradada rapidamente nos terminais nervosos; (iii) encontra-se distribuída em diversas áreas do cérebro, com níveis mais elevados em zonas envolvidas na inibição da dor; (iv) a sua sequência (L-tirosina-L-arginina) encontra-se presente em outros péptidos analgésicos; (v) é libertada em resposta a estímulos despolarizantes; e (vi) liga a receptores acoplados a mecanismos demobilização de Ca2+. Como se trata de um pequeno péptido, a quiotorfina não possui uma conformação prevalecente em solução, apresentando um conjunto de estruturas interconvertíveis. O equilíbrio das populações conformacionais está intensamente dependente do pH da solução, favorecendo conformações em trans (mais estendidas) a valores baixos de pH, e conformações cis (mais compactas) a valores altos. Como a quiotorfina possui quatro grupos tituláveis, a grande dependência do seu estado de protonação com opH é algo esperado. A influência do pH na conformação da quiotorfina é portanto de grande interessepara os estudos de interacção com o seu receptor, já que pode ser um factor mediador desta interacção. Para além do pH, existem outros factores que regulam a interacção da quiotorfina com o seu receptor. Foi hipotetizado, em 1986 por Sargent e Schwyzer, que a membrana lipídica pode ser um factor de extrema importância no processo de ligação de pequenos péptidos aos seus receptores,s egundo um modelo que apelidaram de “catálise membranar”. Segundo esta teoria, um pequeno péptido com uma grande liberdade conformacional em solução, ao colidir com a membrana, e influenciado pela difusão e interacções electrostáticas, desenvolveria uma estrutura mais ordenada. A membrana serviria então como um mediador da interacção entre o péptido e o seu receptor, favorecendo uma conformação mais apta à formação do complexo receptor-ligando. Pretendemos, neste trabalho, estudar a interacção da quiotorfina com uma membrana lipídica num intervalo amplo de pH por métodos computacionais. Embora a abordagem mais comum para a resolução de um problema biológico seja por via experimental, sistemas como o que nos propomos estudar podem beneficiar de uma abordagem teórica/computacional, pelo que optámos por utilizar métodos de simulação molecular. O estudo de péptidos em sistemas membranares requer a consideração simultânea da sua dinâmica conformacional e da protonação/desprotonação dos grupos tituláveis, cujo acoplamento deverá mediar a sua função biológica. Apesar de já ser possível realizar simulações de mecânica/dinâmica molecular de membranas a nível atómico, o tratamento dos grupos tituláveis é bastante limitado nesse tipo de estudos. Com efeito, a conformação e protonação são tratadas de uma forma desacoplada e complementar: os métodos de mecânica/dinâmica molecular tratam adequadamente a dinâmica estrutural de um sistema com estados de protonação fixos, enquanto que os métodos de electrostática simplificados são apropriados para tratar mudanças de protonação num sistema de conformação rígida. Em resposta a este problema, surgiram os métodos de dinâmica molecular a pH constante, que permitem alterações de protonação durante uma simulação de dinâmica molecular. Em vez de definir os estados de protonação fixos que cada centro titulável possuiria a um dado valor de pH, estes métodos permitem que o pH seja definido como um parâmetro externo, como num procedimento experimental típico. O método de dinâmica molecular a pH constante utilizado neste trabalho é uma variante do método de titulação estocástica previamente utilizado em estudos de proteínas e péptidos em solução.A primeira fase deste trabalho consistiu na adaptação do método para lidar com sistemas membranares, algo que não havia sido implementado ainda. A aplicação desta nova implementação do método detitulação estocástica à interacção da quiotorfina com bicamadas lipídicas é um estudo pioneiro nestaárea. Este trabalho tem então três objectivos principais: (i) a adaptação do método de titulação estocástica para permitir a inclusão explícita de membranas; (ii) a simulação da quiotorfina na presençade uma membrana lipídica a diferentes valores de pH utilizando esta nova implementação do método; e(iii) a comparação dos resultados obtidos com os obtidos previamente por estudos experimentais e computacionais.Os resultados obtidos mostram que a quiotorfina possui um perfil de titulação com pequenas diferenças quando em solvente aquoso ou em membrana, e que mostra concordância com o perfil obtido por métodos computacionais semelhantes. As curvas individuais dos quatro grupos tituláveis da quiotorfina exibem diferenças devido à presença da membrana. O grupo terminal amina da quiotorfina,o mais importante devido à sua titulação a valores fisiológicos de pH, possui um valor de pKa mais baixo na presença da membrana, o que vem contrapor os resultados de outros estudos computacionais. No entanto, convém referir que o nosso método permite fazer simulações fisiologicamente mais realistas, pelo que discutimos as diferenças obtidas entre ambos os métodos. Relativamente aos aspectos conformacionais da quiotorfina, os resultados que obtivemos são concordantes com os obtidos por outros autores. Existe uma dependência conformacional da quiotorfina com o pH, o que era esperado devido ao número de centros tituláveis do péptido. A tendência para a quiotorfina adoptar estruturas mais compactas ou mais estiradas demonstra uma dependência com o pH de acordo com o que foi previamente observado. Mostramos ainda que existe uma limitação conformacional da quiotorfina quando na presença da membrana, resultando na perda, embora ligeira, de rotações internas, o que está de acordo com o modelo de “catálise membranar”.A inserção da quiotorfina na membrana é também influenciada pelo pH, que afecta inclusivamente a penetração relativa dos seus diferentes grupos. À medida que o pH se torna mais alcalino, existe uma tendência de afastamento do péptido em relação à membrana, o que está de acordo com resultados obtidos experimentalmente, que mostravam que a constante de partição do péptido a valores de pH mais ácidos era mais elevada do que a valores mais alcalinos. Ao observar a inserção do péptido na membrana, deparámo-nos com alguns casos particulares previamente inobservados, nomeadamente afastamentos esporádicos a valores de pH elevados. Discutimos esses casos individualmente, concluindo que estão associados a protonações/desprotonações facultadas pelo método de dinâmica molecular a pH constante utilizado, e que a sua ocorrência é mais uma vez consistente com as partições observadas experimentalmente. Finalmente, fizemos um fit das melhores estruturas da quiotorfina sobre parte da estrutura da morfina, um analgésico opióide cujo receptor está bem descrito, e observámos uma sobreposição quase perfeita, o que demonstra que a quiotorfina é capaz de reproduzir algumas das restrições conformacionais impostas pela presença de um receptor do tipo opióide

Topics: Quiotorfina, Membrana, pH, Modelação molecular, Dinâmica molecular a pH constante, Teses de mestrado - 2009
Year: 2009
OAI identifier: oai:repositorio.ul.pt:10451/3498

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Citations

  1. (1986). Free energy of charges in solvated proteins: microscopic calculations using a reversible charging process. doi

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