Location of Repository

Exploring the therapeutic potential of recombinant AAV vectors in stem cell and transplantation model systems for the treatment of heart diseases

By Natascha Schuhmann

Abstract

Herzerkrankungen sind weltweit die Hauptursache für einen vorzeitigen Tod. Sowohl Gentransfer als auch zelluläre Therapien werden derzeit als neue Behandlungsmöglichkeiten für diese Erkrankungen entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte der AAV-vermittelte Gentransfer von Transgenen ins Herzgewebe von Donororganen, die anschließend transplantiert wurden, etabliert werden. Als Tiermodelle für die heterotopen Herztransplantationen wurden Sprague Dawley Ratten und Deutsche Landrasseschweine gewählt. rAAV2, welcher für diesen Zweck als geeignet beschrieben wurde, wurde intracoronar entweder in das normotherme oder hypotherme Herz appliziert, welches anschließend in eine Empfängerratte transplantiert wurde. Der Gentransfer erfolgte mit einer besseren Effizienz in normotherme Herzen. Trotz des erfolgreichen Transfers und der Nachweisbarkeit von Vektor-DNA in Gewebeproben 28 Tage nach Transplantation konnte jedoch weder Transgen-spezifische mRNA noch Proteinexpression detektiert werden. Zur Bestimmung potentieller Barrieren, welche die rAAV2-vermittelte Transgenexpression in unserem Rattenmodell beeinträchtigen, wurden in vitro Analysen in Rattenaortenendothelzellen durchgeführt. Wir konnten Zelleintritt und intrazelluläres trafficking der viralen Partikel ebenso als inhibierende Faktoren ausschließen wie die Expression vom gewählten CMV Promotor. Die signifikante Erhöhung der Transgenexpression für AAV1 (der effizienteste Serotyp) und AAV2 nach Applikation des Proteasomeninhibitors MG132 deutet auf eine Blockierung in der Vektordegradation hin. Darüberhinaus sind auch indirekte Effekte wie eine erhöhte Ubiquitinierung des Vektorkapsids denkbar, von der man annimmt, dass sie das sogenannte vector uncoating oder die Translokation in den Nucleus erleichtert. Des Weiteren konnte eine geringfügig eingeschränkte Fähigkeit zur Zweitstrangsynthese beobachtet werden. Diese wird benötigt, um das einzelsträngige DNA-Genom herkömmlich verwendeter AAV-Vektoren in einen transkribierbaren Doppelstrang zu verwandeln. Zusammenfassend muss man feststellen, dass sich die analysierten rAAV Serotypen als ungeeignete Gentransfervektoren für Rattenendothelzellen erwiesen haben. Im Gegensatz dazu wurde in primären Rattencardiomyocyten in vitro eine deutlich höhere Transduktionseffizienz erzielt. Um in vivo sowohl Endothelzellen als auch Cardiomyocyten zu transduzieren verwendeten wir die vasoaktive Substanz Histamin in unserem porcinen Transplantationsmodell. Der durch in vitro Versuche als geeignet ermittelte Serotyp 2 wurde unter Verwendung des neuentwickelten in situ Langendorff Reperfusionssystems zusammen mit Histamin in das normotherme Herz appliziert. In beiden Tieren konnte der Nachweis eines erfolgreichen Gentransfers anhand deutlich messbarer Transgen-DNA-Mengen erbracht werden. In einem der beiden Tiere wurde zudem funktionales Protein nachgewiesen. Dieses Schwein hatte zehnmal höhere Vektormengen erhalten. Dieser Vektor kodierte zudem für das Transgen Luciferase und wies eine self-complementary (Pseudo-Doppelstrang) Vektorgenom-Konformation auf. Im Gegensatz dazu wurde das Schwein, das keine Expression zeigte, mit einem Vektor behandelt, der für beta-Galaktosidase in einer Einzelstrang-Vektorgenom-Konformation kodierte. Obwohl weitere Experimente zur Bestimmung des Einflusses der drei Parameter (Vektormenge, Vektorgenom-Konformation und Wahl des Transgens), einzeln oder in Kombination, benötigt werden, konnten wir zeigen, dass ein rAAV2-vermittelter Gentransfer in porcines Herzgewebe im Rahmen eines (Xeno-) Transplantationsansatzes im Prinzip möglich ist. Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde ein Protokoll zur effizienten Transduktion humaner CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut etabliert. Derartige Protokolle ermöglichen eine Kombination von Zell- und Gentherapie, welche für ein breites Spektrum an Anwendungen vorteilhaft ist. Vergleiche der Serotypen 2, 3 und 5 ermittelten rAAV2 als den effizientesten Serotyp in Zelleintritt und Transgenexpression. Der Zelleintritt von rAAV2 in CD34+ Zellen war abhängig von Heparansulfatproteoglycan und von alpha-5-beta-1 Integrin. Darüberhinaus ist die Synthese des Zweitstrangs in CD34+ Zellen beeinträchtigt, da nur die Zugabe von Vektoren mit Genomen in der self-complementary Konformation in erfolgreichen Transduktionen resultierte. Die ohnehin schon sehr effiziente Transduktion vorexpandierter Zellen mit rAAV2 mit self-complementary Genomen konnte signifikant durch die Zugabe von all-trans Retinsäure und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A erhöht werden. Darüberhinaus weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass Transduktionen mit rAAV nicht mit der Fähigkeit der CD34+ Zellen zur endothelialen Differenzierung interferieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass unter Verwendung des etablierten Protokolls CD34+ Zellen effizient mit rAAV2 transduziert werden können und sich rAAV2 somit als geeignetes Vektorsystem zur transienten Modifikation dieser Zellen anbietet

Topics: Life sciences
Year: 2008
OAI identifier: oai:USBKOELN.ub.uni-koeln.de:2673

Suggested articles

Preview


To submit an update or takedown request for this paper, please submit an Update/Correction/Removal Request.