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Charakterisierung der asymmetrischen Funktionalität der Nukleotidbindedomänen des ABC-Transporters TAP

By Hicham Bouabe

Abstract

Der Transporter associated with antigen processing (TAP) gehört zur Familie der ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter (Higgins 1992). TAP besteht aus zwei Untereinheiten TAP1 und TAP2. Jede Untereinheit besteht aus einer Transmembrandomäne (TMD) und einer Nukleotidbindedomäne (NBD). Sowohl die TMDs als auch die NBDs sind funktional verschieden (Alberts et al. 2001, Daumke et al. 2001, Lapinski et al. 2001). Bei den NBDs beruht die unterschiedliche Funktionalität auf intrinsischen Eigenschaften (Daumke et al. 2001). In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit die ca. 70 Aminosäuren langen C-termini (V-Regionen) und die Kern-NBDs von TAP (siehe Abbildung I.6.) die asymmetrische Funktionalität der Nukleotidbindedomänen bedingen. Dazu wurden rekombinante Transporter hergestellt, in denen die C-Termini oder die Kern-NBDs zwischen NBD1 und NBD2 wechselseitig ausgetauscht wurden (siehe Abbildung I.6.). Überdies wurde eine weitere TAP2-Mutante, der die C-terminale V-Region fehlt, hergestellt. Die cDNAs für diese chimären Transporter wurden in TAP-negativen T2-Zellen stabil transfiziert. Es wurden insgesamt sechzehn T2-Zelllinien, die stabil ein oder zwei TAP-Ketten exprimieren, etabliert. Bei den Untersuchungen zum Nukleotidbindeverhalten stellte sich heraus, daß der C-Terminus von TAP2 eine für ATP-Bindung ungünstige Konformation in der NBD hervorruft, während der C-Terminus von TAP1 die Bindung von ADP und ATP zulässt. Der C-Terminus von TAP2 (V2) stellt möglicherweise einen limitierenden strukturellen Faktor dar, der die Nukleotidbindung während des Transportzyklus reguliert. Die Bindung von ATP in NBD2 blockiert simultane ATP-Bindung in NBD1, was auf eine strukturelle Wechselwirkung zwischen den beiden NBDs hindeutet. Überdies konnte gezeigt werden, daß die ADP-Bindung eine gegebene intrinsische Eigenschaft der Kern-NBD2 ist. Ein verändertes Verhalten bedingt durch die C-Termini wurde auch bei den Peptidbindeeigenschaften der chimären Transporter festgestellt. Die Untersuchungen zum Peptidbindeverhalten zeigten, dass, unabhängig von der Art der Nukleotidbindung der an die TMDs fusionierten NBDs, ein Einfluss auf die Peptidbindung von den NBDs ausgeht. Die Untersuchungen zur Transportaktivität zeigten, daß nur der Transporter 2/1C2 eine nennenswerte Aktivität aufweist. Dies deutet darauf hin, daß die Kern-NBD2 (C2) die Kern NBD1 (C1) ersetzen kann aber umgekehrt nicht. Das spricht dafür, daß der C-Terminus mit der Kern-NBD in Wechselwirkung tritt, diese Wechselwirkung ist in der hergestellten NBD: C1V2 zerstört. Zur Charakterisierung der entscheidenden Aminosäuren, die für den beobachteten Einfluß des C-Terminus verantwortlichen sein könnten, wurden TAP-cDNAs, in denen die Switch-Regionen zwischen NBD1 und NBD2 ausgetauscht wurden, hergestellt. Diese wurden in TAP-negativen T2-Zellen transfiziert und sollen in weiterführenden Studien charakterisiert werden

Topics: ddc:570
Year: 2002
OAI identifier: oai:USBKOELN.ub.uni-koeln.de:1634
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