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Transgenic mouse models enabling photolabeling of individual neurons in vivo

By Manuel Peter

Abstract

Viele grundlegende Prinzipien der Funktion neuronaler Netzwerke sind noch immer unbekannt. Eine Theorie besagt, dass die gleichzeitige, geordnete Aktivität vieler Nervenzellen im Cortex das grundlegende Substrat höherer Gedaechtnissfunktionen ist. Allerdings ist der Mechanismus wie und warum diese Aktivitätsmuster entstehen unbekannt. Ein grundlegendes Problem dies genauer zu untersuchen ist, dass die experimentellen Werkzeuge dazu noch immer fehlen. Darum ist es nicht möglich die spezifische Funktion einer Nervenzelle in einem neuronalen Netzwerk festzustellen. Deshalb wäre es ein großer Fortschritt Nervenzellen anhand ihrer Aktivität im Netzwerk zu markieren. Dies würde uns erlauben diese Zelle wieder zu identifizieren und weiteren Analysen zu unterziehen. Dadurch wäre es uns möglich mehr über die Verbindungen zu anderen Nervenzellen, die Proteinexpression oder die Morphologie dieser Zelle zu erfahren. \ud In dieser Arbeit testeten wir zwei verschiedene Strategien um Nervenzellen zu markieren. Zuerst untersuchten wir die Spezifität der Genexpression früher Gene im auditorischen Cortex. Wir verwendeten ein vom auditorischen Cortex abhängiges Lernprotokoll und testeten die Genexpression der zwei Gene c-fos und Arc. Weiters testeten wir auch andere Verhaltensprotokolle um lerninduzierte Genexpression von unspezifisch induzierter Genexpression zu unterscheiden. Wir fanden einen starken Anstieg beider Gene bei allen Protokollen die einen Schock beinhalteten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass auch andere unspezifische Faktoren die Expression von c-fos und Arc aktvieren können. Weiters verwendeten wir eine mRNA Mikroarray Analyse um weitere lernspezifisch aktivierte Genen zu finden. Auch in diesem Experiment fanden wir einen starken Anstieg bekannter früher Gene konnten aber keinen neuen Genen die spezifisch während des Lernens aktiviert werden finden.\ud Die zweite Strategie beruht auf photoaktivierbaren fluoreszierenden Proteinen. Wir testeten ob es mit diesen Proteinen möglich ist Zellen im lebenden Gehirn konditional zu markieren. Dafür testeten wir sechs verschiedenen photoactivierbare Proteine und generierten drei Mäuselinien die photoactivierbares GFP expremieren. Mit diesen Mäusen ist es möglich einzelne Zellen in vivo für viele Stunden zu markieren. Durch die Markierung können diese Zellen auch in Hirnschnitten wiedergefunden und dadurch weiter charakterisiert werden. Weiteres kann Photolabeling auch mit funktionellem Calicum Imaging kombiniert werden. Dadurch ermöglichen es diese Mäuse eine direkte Verbindung zwischen der Aktivität einzelner Zellen in einem Netzwerk mit einer weiteren Charakterisierung dieser Zellen herzustellen. Wir testeten diese Mäuse und korrelierten die spontane in vivo Aktivität einzelner Zellen mit der Genexpression des frühen Genes c-fos. Wir fanden, dass die c-fos Genexpression sehr variable in stark aktive Nervenzellen war und konnten keine Korrelation zwischen hoher spontaner Aktivität und hoher c-fos Genexpression finden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass auch andere, unspezifische Faktoren die c-fos Genexpression beeinflussen können. Diese Ergebnisse zeigen wie wichtig es ist Neuronen unabhängig von frühen Genen markieren zu können. Wir erreichten das durch die PA-GFP expremierenden Mäuselinien. Weiters kann die photolabeling Methode auch auf andere Zelltypen angewandt werden.It is believed, that activity patterns in the cortex are correlates of higher brain functions such as perception or decision making. However the mechanisms how and why these activity patterns emerge are not known. One major experimental obstacle to understand the function of brain circuits is the lack of tools to determine both the precise function of a neuron and its position in the connectivity diagram of the circuit. Therefore, it would be necessary to tag neurons in vivo at single cell resolution, based on functional criteria, and to re-identify these neurons in vitro. This would allow us to obtain more information about the connectivity, the gene expression or the morphology of these neurons and thus to gain information that goes beyond its in vivo activity pattern. This information is crucial to gain a mechanistic understanding of the neurons function.\ud We conceived two strategies to label neurons in the auditory cortex in vivo. First we tested if immediate early genes can be reliable markers to tag active neurons in the auditory cortex during associative learning. We established an auditory cued fear conditioning protocol that depends on the auditory cortex and tested the expression of c-fos and Arc using quantitative PCR following the acquisition of this fear memory. We also compared paired conditioning to several control paradigms to disassociate gene expression that arises from the learning event from gene expression that arises from other factors unrelated to associative learning. We found that c-fos and Arc show strong induction after paired fear conditioning but also in all other paradigms that involved shocks indicating that other unspecific factors or cross-modal inputs can activate immediate early gene expression in the auditory cortex. We further used a near genome wide mRNA microarray analysis to screen for genes other than c-fos and Arc that could be specifically upregulated during learning. We again observed upregulation of known immediate early genes but could not detect genes specifically induced by associative learning to sound.\ud The second strategy is based on photoactivatable fluorescence proteins. We explored the ability of photoactivatable fluorescence proteins to serve as conditional markers in the living brain. We tested six PA-FPs and generated mouse lines expressing PA-GFP::NLS either under the Thy1.2 promoter or conditionally as a knock in construct from the Rosa26 locus. Using two-photon excitation we were able to conditionally label neurons at single cell resolution in vivo for many hours. Labeling greatly facilitated re-identification of these neurons in vitro in acute brain slices and in fixed samples and can therefore be combined with targeted patch clamp recordings and histology. Furthermore, photolabeling can also be combined with functional in vivo calcium imaging which allows us to link in vivo neuronal activity with a further analysis of these neurons. We demonstrate this by correlating spontaneous activity levels in the auditory cortex with a histological analysis of c-fos expression. We observed that particularly active neurons can have highly variable c-fos expression levels and we could not find a direct correlation between neuronal activity and c-fos expression. Furthermore, the results from both studies highlight that IEG expression is also controlled by other factors than neuronal activity. This again emphasizes the value of a methode to label neurons independent of IEG expression. In this study we achieved this by generating PA-GFP expressing mice to photolabel neurons. This photolabeling approach can also be applied to other cell types and fields of biology

Topics: 42.13 Molekularbiologie, PA-GFP / photolabeling / in vivo, mouse / immediate early genes / c-fos, PA-GFP / photolabeling / in vivo / mouse / immediate early genes / c-fos
Year: 2012
OAI identifier: oai:othes.univie.ac.at:19066
Provided by: OTHES
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