HIV infection and follicular helper T cells : interrogating the SAMHD1 contribution through HIV-2

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023O vírus da imunodeficiência humana (VIH) continua a representar um problema global de saúde. Atualmente 38,4 milhões de pessoas vivem infetadas com o VIH, tendo sido descritos 1,5 milhões de novos casos em 2021. Apesar de tanto VIH tipo 1 (VIH-1) como tipo 2 (VIH-2) poderem levar ao desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), há uma associação mais frequente do VIH-1 a um trajeto relativamente mais fulminante. O VIH-2, por outro lado, associa-se comumente a um percurso mais insidioso, lento e quase “benigno”, sendo que alguns doentes vivem uma vida com reduzidas comorbilidades, carga viral baixa e não chegam a desenvolver SIDA. Tanto VIH-1 como VIH-2 podem sofrer mutações que conferem ao vírus resistência aos tratamentos disponíveis, reforçando a importância dos estudos do VIH não só para minimizar os efeitos adversos dos antirretrovirais, mas também para explorar estratégias para a eliminação das células infetadas. A infeção pelo VIH tipo 1 (VIH-1) e tipo 2 (VIH-2) apresenta variadas semelhanças, nomeadamente as mesmas vias de transmissão, o alvo de células T CD4 e a utilização de CD4 como recetor principal e de CXCR4 e/ou CCR5 como coreceptores. No entanto, existem algumas diferenças a nível molecular e no estabelecimento e progressão da infeção. A nível molecular, existem diferenças nas suas proteínas, como por exemplo os complexos de glicoproteínas do envelope que facilitam a entrada do vírus na célula são diferentes (gp120 e gp41 no VIH-1, gp105 e gp36 no VIH-2), ainda que equivalentes entre si. As proteínas acessórias entre VIH-1 e VIH-2 também diferem, nomeadamente a ausência da proteína Vpu e a presença da proteína Vpx no caso do VIH-2 em comparação com VIH-1. Ainda que seja possível controlar a infeção por VIH com recurso à terapia antirretroviral, esta não erradica as células infetadas pelo vírus, denominadas reservatórios virais, que podem permanecer num estado latente por um período indeterminado, através de mecanismos que ainda não estão totalmente esclarecidos. Apesar de várias células que expressam o recetor CD4 serem reservatórios virais, algumas subpopulações de células T CD4 são considerados mais relevantes. As células T CD4 auxiliares foliculares (Tfh) são um reservatório importante tanto para VIH-1 como VIH-2. Tfh são uma subpopulação. especializada de linfócitos CD4 que se localizam nos órgãos linfoides secundários, nomeadamente na amígdala. Estas células caracterizam-se pela elevada expressão de marcadores celulares como CXCR5, ICOS e PD-1 – marcadores estes que definem a linhagem Tfh –, mas também de Bcl-6, o principal regulador da diferenciação das Tfh. Não só Bcl-6 está envolvido na diferenciação das Tfh, como tem um impacto na suscetibilidade das Tfh à infeção por VIH ao modular fatores de restrição contra estes vírus. Um destes fatores de restrição do hospedeiro é SAMHD1 (do inglês sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1), que é uma proteína com função de dNTPase, que regula a concentração de desoxiribonucleótidos fosfatados (dNTPs) no citosol, hidrolisando-os, e reduzindo a sua disponibilidade quando a enzima se encontra no seu estado desfosforilado, e, portanto, ativo. Quando fosforilado, SAMHD1 correlaciona-se com níveis mais elevados de dNTPs, traduzindo-se numa diminuição desta atividade enzimática, permitindo a replicação do DNA celular durante a fase S, e assim reduzindo estes níveis em células quiescentes nas quais se registam níveis mais elevados de SAMHD1. Além deste papel no ciclo celular, a redução da disponibilidade de dNTPs inibe a transcrição reversa do VIH e, adicionalmente, estudos mostraram que o SAMHD1 impede a expressão de genes do VIH-1, demonstrando a sua importância enquanto fator de restrição de hospedeiro contra o VIH. O VIH-2 é capaz combater SAMHD1 pela expressão da referida proteína Vpx que direciona SAMHD1 para degradação proteossómica, ultrapassando este mecanismo de restrição. Estudos prévios também demonstraram que a Vpx confere uma vantagem para o estabelecimento da infeção quando associada ao VIH-1. Apesar de sabermos que Tfh expressam elevados níveis de Bcl-6 e baixos níveis de SAMHD1, pouco se sabe acerca do papel de SAMHD1 na suscetibilidade das Tfh à infeção pelo VIH. Neste estudo exploramos a capacidade de degradação do SAMHD1 através do VIH-2, conferida pela proteína Vpx, para melhor investigar a interação entre SAMHD1 e HIV em células Tfh. Tendo esses aspetos em conta, colocamos a hipótese de que, através da diminuição dos níveis de SAMHD1 que conferem um entrave à replicação do VIH, o VIH-2 apresentaria algum tipo de vantagem em infetar estes subpopulações celulares de T CD4, nomeadamente no caso de células quiescentes que apresentam os referidos níveis constitutivamente elevados de SAMHD1 e que serão, por esse motivo, menos suscetíveis à infeção na ausência da Vpx. Questionámos, ainda, se esta modulação negativa dos níveis de SAMHD1 pelo VIH-2 impactaria de modo algum o processo de diferenciação das Tfh, comparativamente a células infetadas por VIH-1 e células não infetadas. Primeiramente, explorámos a infeção por HIV-2 de subpopulações purificadas a partir de células mononucleares isoladas de amígdalas humanas obtidas eticamente, com níveis distintos de SAMHD1, nomeadamente Tfh (CXCR5+ICOSbrightPD-1bright) e triple negative (TN, CXCR5negICOSnegPD-1neg), posteriormente infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com tropismos diferentes para os coreceptores, CXCR4 ou CCR5. Analisando os dados gerados, observámos que, apesar de uma maior expressão de SAMHD1, as TN apresentaram elevados níveis de DNA viral total e gag mRNA após 24h de infeção com isolados primários de VIH-2 ou VIH-1, independentemente do coreceptor utilizado. Tanto VIH-1 como VIH-2 conseguem infetar TN e Tfh, indiciando uma ausência de vantagem para o VIH-2 no combate ao SAMHD1. Todavia, os níveis de DNA viral total foram superiores nas Tfh, para ambas as infeções, o que está de acordo com o descrito na literatura. Apesar dos níveis baixos de SAMHD1 em Tfh em comparação com TN, verificámos que existe uma heterogeneidade da expressão de SAMHD1 em células que expressam CXCR5, que não aparenta estar relacionada com a expressão de nenhum marcador característico das Tfh, nomeadamente Bcl-6, OX40, e CD57. Para avaliar se a infeção pelo VIH-2, e consequentemente a diminuição de SAMHD1 por Vpx, tem impacto na produção de Tfh, realizámos um ensaio com base num protocolo previamente padronizado para a diferenciação in vitro de Tfh. Para isso, células T CD4 naïve isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico foram estimuladas e mantidas em cultura com um cocktail de citocinas para promover a diferenciação das Tfh. Estas células foram infetadas com isolados primários de VIH-2 e VIH-1 com duplo tropismo para CXCR4 e CCR5, de forma a contornar qualquer viés induzido pelo tropismo para um determinado coreceptor. Realizámos fenotipagem por citometria fluxo e recolhemos cell pellets para PCR quantitativo em diferentes dias de cultura. Surpreendentemente, a frequência das Tfh geradas demonstraram-se semelhantes após infeção com VIH-2 e VIH-1, bem como quando comparadas com o controlo não infetado. Mais, as Tfh geradas neste protocolo apresentam expressão semelhante de diversos marcadores associados às Tfh, indicando um fenótipo similar independentemente da condição de infeção (VIH-2, VIH-1 ou o controlo não infetado). Concluindo, o VIH-2, apesar de hospedar a Vpx, não apresentou vantagem significativa em infetar células T CD4 amigdalinas humanas, independentemente dos seus níveis distintos de SAMHD1. Para além disso, a infeção pelo VIH-2 não modulou a quantidade ou a qualidade das células Tfh geradas com o protocolo diferenciação in vitro de Tfh. Estes primeiros dados utilizando isolados primários de VIH-2 incentivam a investigação de mecanismos adicionais no estabelecimento de reservatórios Tfh, bem como as suas implicações na infeção por VIH-2.Antiretroviral therapy does not eradicate HIV-infected cells, also known as viral reservoirs. Follicular helper CD4 T cells (Tfh), a specialized subset of CD4 lymphocytes, have been shown to be important HIV reservoirs, for both HIV type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2). Bcl-6, the regulator of Tfh differentiation, has been shown to impact cellular susceptibility of Tfh to HIV infection by modulating the expression of HIV restriction factors. One of these restriction factors is SAMHD1 which has been shown to impair HIV-1 gene expression. HIV-2 can counteract SAMHD1 due to the expression of Vpx. Here we explore that ability to further investigate the interplay of SAMHD1 and HIV in Tfh. Firstly, we explored HIV-2 infection of sort-purified subsets from human tonsils with distinct levels of SAMHD1: Tfh (CXCR5+ICOSbrightPD-1bright) and triple negative (TN, CXCR5negICOSnegPD-1neg). Despite higher SAMHD1 expression, TN also presented high levels of total HIV DNA and gag mRNA upon 24h infection with either HIV-2 or HIV-1 primary isolates. Nevertheless, total HIV DNA levels were higher in Tfh in both infections. Then, we asked whether HIV-2 infection biased Tfh generation using a standardized protocol for in vitro Tfh differentiation from naïve cells. Surprisingly, the frequency of the generated Tfh and their detailed phenotype were remarkably similar upon effective infection with HIV-2 or HIV-1 primary isolates. In conclusion, HIV-2, despite harbouring Vpx, did not feature a significant advantage to infect tonsillar CD4 T cells, irrespectively of their SAMHD1 levels, and did not modulate in vitro Tfh differentiation. These first data using HIV-2 primary isolates prompt the investigation of additional paths in the establishment of Tfh reservoirs, and their implications for the benign course of HIV-2

Comunicação em saúde : problemas actuais e proposta de solução imediata : a propósito de um caso clínico

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Em Portugal, muitos doentes têm o seu seguimento médico fragmentado (múltiplos profissionais, em instituições diferentes com sistemas de informação próprios), o qual beneficiaria de uma centralização eficaz dos Cuidados de Saúde no Médico de Família. A falta de coordenação entre os profissionais de diversas especialidades, muitas vezes percorridas pelo utente, pode conduzir a prolongamento da sintomatologia e tratamentos inapropriados, conducentes a iatrogenia. Tal é discutido usando como ponto de partida o caso de PS, sexo feminino, 24 anos, com quadro de lombalgia com incapacidade funcional para a marcha, desde Agosto de 2020. Em 18 meses, a doente foi acompanhada por vários médicos diferentes, iniciou 51 medicamentos e foi submetida a 28 métodos complementares de diagnóstico, excluindo exames analíticos laboratoriais, levando os 12 exames radiológicos a uma exposição total de 49,93mSv de radiação efectiva, sem que houvesse uma reunião interdisciplinar para uma análise holística do caso. Além de não ter havido um controlo adequado da dor, houve inclusive novos sintomas iatrogénicos (diarreia crónica e palpitações), pelo que teria sido essencial a conversa entre as diversas especialidades. Este trabalho sugere a utilização de uma aplicação digital que permita aos médicos interessados, das diversas especialidades e sistemas de saúde, comunicar entre si e criar facilmente as suas próprias reuniões interdisciplinares, aliado à criação do Boletim do Adulto em “Risco de Iatrogenia” (BARI), em papel, distribuído aos utentes com medicação inapropriada (Critérios START/STOPP), polipatológico e/ou com dor crónica. Adicionalmente, sugerese um projecto piloto e o respectivo plano dos primeiros 7 meses de implementação.In Portugal, many patients have their medical care fragmented (with multiple professionals, in different healthcare institutions - using their own information systems) and would benefit from the centralization of healthcare under the Family Physician. The lack of coordination between professionals of the various specialties, may result in an extension of the duration of symptoms and inappropriate treatments, leading to iatrogenics. This issue is illustrated by the case of PS, a 24-year-old female with a history of low back pain with impairment in walking since August 2020. Over the course of 18 months, the patient had appointments with multiple doctors, started 51 medications, and underwent 28 diagnostic methods, excluding analytical laboratorial exams, with 12 imaging exams resulting in exposure to a total effective radiation dose of 49.93 mSv, without an interdisciplinary meeting for a holistic analysis of the case. In addition to inadequate pain control, new iatrogenic symptoms (chronic diarrhoea and palpitations) emerged, highlighting the importance of communication between different specialties. This thesis proposes the use of a digital application that allows interested physicians, from different specialties and institutions, to communicate with each other and easily create their own interdisciplinary meetings, along with the creation of the Iatrogenic Risk Adult Bulletin (BARI – Boletim do Adulto em Risco de Iatrogenia) in paper. The booklet would be distributed to all adults at risk of inappropriate polypharmacy (START/STOPP Criteria), multiple chronic conditions (Polipathologic Criteria), and/or chronic pain. Additionally, a pilot project is suggested, including a plan for the first 7 months of implementation

Cuidados paliativos pediátricos : qual o conhecimento dos estudantes de medicina, em Portugal?

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Os cuidados paliativos pediátricos (CPP) são um direito básico de todas as crianças e respetivas famílias, devendo ser instituídos precoce e atempadamente no curso de doenças crónicas complexas ou limitantes da vida. São conhecidos vários obstáculos à prestação de CPP de qualidade, um destes sendo a falta de formação dos estudantes de medicina e médicos nesta área. Diversos estudos têm demonstrado lacunas no conhecimento dos estudantes acerca de conceitos básicos dos CPP. Os benefícios da formação em CPP transcendem os cuidados prestados a crianças, sendo importante para capacitar os alunos na sua relação médico-doente e promover melhores cuidados de saúde à população. Como o objetivo de averiguar o nível de conhecimento dos estudantes de medicina em Portugal sobre os CPP, foi desenvolvido um questionário, divulgado online, que recebeu 250 respostas. Cerca de 82,8% dos alunos referiam saber em que consistem os CPP e 34,5% referem que os CPP são um tema abordado na área da Pediatria durante a sua formação. A maioria não se encontra informado acerca da realidade portuguesa. A maior parte dos alunos demonstrou possuir conhecimentos básicos acerca da filosofia dos CPP. Dos inquiridos, 61,2% não se sentem capazes de instituir controlo sintomático, 30,4% não se consideram capazes de comunicar más notícias à família e 41,6% não se sentem capazes de prestar apoio no processo de luto. Quase todos os inquiridos concordam que a formação em CPP melhoraria a suas capacidades na comunicação médico-doente e os tornaria melhores médicos. Os estudantes de medicina beneficiariam de formação na abordagem do controlo sintomático. O desenvolvimento das suas competências relacionais seria uma mais-valia na promoção de empatia e estabelecimento da comunicação médico-doente. A inclusão do ensino dos CPP no currículo médico pediátrico em Portugal seria importante para capacitar os futuros médicos na sua tomada de decisão, independentemente da sua especialidade.Pediatric palliative care (PPC) is a basic right for all children and their families and should be instituted early and timely in the course of complex or life-limiting chronic illness. There are several known barriers to the provision of quality PPC, one of these being the lack of training of medical students and physicians in the field. Several studies have demonstrated gaps in students' knowledge of basic PPC concepts. The benefits of training in PPC go beyond the care provided to children, being important to empower students in their doctor-patient relationship and to promote better health care to the population. To assess the level of knowledge about PPC among medical students in Portugal, a questionnaire was developed and published online, which received 250 responses. About 82,8% of students reported knowing what PPC is and 34,5% stated that PPC is a topic discussed in Pediatrics during their education. Most of them was not informed about the Portuguese reality in this subject. Most students showed basic knowledge about the philosophy of PPC. Of the respondents, 61,2% did not feel able to institute symptomatic control, 30,4% did not consider themselves able to communicate bad news to the family and 41,6% did not feel able to provide support in the grieving process. Almost every student agreed that training in PPC would improve their skills in doctorpatient communication and would make them better doctors. Medical students would benefit from training in the approach of symptomatic control. The development of their communication skills would promote empathy and improve their doctor-patient communication. The inclusion of PPC teaching in the medical curriculum in Portugal would be important to empower future physicians in their decision making, regardless of their specialty

Portugal ingovernável? Da maioria absoluta à absoluta minoria

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O ano de 2023 e o futuro próximo

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Reenactment : entre arquivo e criação

Este trabalho propõe um estudo de três casos práticos de performances reenactment: Freeing My Hair (2021) e Freeing COVID19 Memories (2021), dois reenactments realizados por Nathalie Ward a partir da documentação das performances Art Must Be Beautiful, Artist Must Be Beautiful (1975) e Freeing the Memory (1975), trabalhos da artista Marina Abramovic, bem como o reenactment Action Pants: Genital Panic (2005), realizado por Abramovic com base na documentação da obra de VALIE EXPORT, Aktionshose: Genitalpanik (1969). A investigação dos casos implica um pensamento dos arquivos como objeto da prática criativa nas artes performativas, pelo emprego de múltiplas ativações e reativações das documentações, tendo em conta as singularidades do corpo de cada performer enquanto intérprete e transcriador da obra que se propõe reativar. Nos cruzamentos e nas dobragens de tempos, espaços, obras e performers, os reenactments promovem retornos criativos, resgatando um passado complexo que, fantasmagoricamente, é reproduzido, mas nunca exatamente da mesma maneira. Talvez possamos assim, caso a caso, ir de encontro à presença de um passado fantasma em constante diferenciação, estabelecendo, pela via da repetição crítica, um diálogo generativo entre tempos, afetos e modos de criar.This work proposes a study of three practical cases of reenactment performances: Freeing My Hair (2021) and Freeing COVID19 Memories (2021), carried out by Nathalie Ward, based on the documentation of the performances Art Must Be Beautiful, Artist Must Be Beautiful (1975) and Freeing the Memory (1975), works by performance artist Marina Abramovic, as well as the reenactment Action Pants: Genital Panic (2005), recreated by Abramovic based on the documentation of Aktionshose: Genitalpanik (1969), a work by VALIE EXPORT. The investigation of the cases entails a reflection on the archives as an object of creative practice in the performing arts, through the use of multiple activations and reactivations of documentation, taking into account the singularities of the body of each performer as interpreter and transcreator of the work she intends to reactivate. At the intersections and folds of times, spaces, works and performers, reenactments promote creative returns, rescuing a complex past that may be ghostly reproduced, yet never in the same way. Case by case, we will perhaps be able to encounter the presence of a ghostly past in permanent differentiation, establishing, by way of critical repetition, a generative dialogue between times, affects, and modes of creating

Development of emulsions stabilized by vegetable proteins to obtain a clean label product

Mestrado em Engenharia Alimentar / Instituto Superior de Agronomia. Universidade de LisboaTraditionally, food emulsions such as mayonnaise are stabilized by egg proteins, namely lipoproteins. However, to respond to the current plant-based trend, there has been an effort to identify vegetable protein sources that fulfill the desired functionalities, without compromising the sensory properties. These proteins present some additional advantages such as the absence of cholesterol and a lower environmental impact than animal protein sources. This work aimed to develop a vegan and clean label mayonnaise, by replacing egg yolk with vegetable protein, obtaining a product aligned with current food trends. Four studies were conducted to achieve the proposed objective: A preliminary study was carried out to optimize the mayonnaise production at laboratory scale (Study 0). In Study I: emulsions with 1.5% (w/w) aquafaba powdered, pea, lupin and faba bean protein were prepared and compared to the standard (commercial mayonnaise). Color, texture (TPA) and rheology (SAOS) measurements indicated that emulsions with lupin and faba bean protein had significant differences (p 0.05). Besides, lupin protein showed a significant impact on mayonnaise structure and consistency. Backscattering and droplet size distribution measurements indicated that, except for faba bean, the emulsions of these two studies are stable. Study III compared emulsions stabilized with two different liquid aquafaba (29% (w/w). Compared to the standard, these two aquafabas showed some differences (p5). A sensory analysis was conducted to the most promising samples and emulsions with liquid aquafaba (LAXE) and 50%Lupin+50%Fababean (1.5% (w/w) protein) had the highest acceptabilityN/

A atribuição de dignidade humana ao embrião in vitro : uma perspectiva jurídica critica

Esta tese explora a complexidade de se estabelecer o estatuto moral e jurídico do embrião humano fertilizado in vitro. A pesquisa é orientada pela pergunta central de se devemos ou não atribuir dignidade ao embrião humano in vitro. Nos deparamos com a incoerência que decorre dos subterfúgios para ao mesmo tempo proteger o embrião sob o manto da dignidade e permitir que seja destruído em pesquisas. A relevância do tema ultrapassa fronteiras nacionais em razão da fertilização in vitro (FIV) ser utilizada em quase todos os países do mundo como primordial mecanismo de solução dos problemas da infertilidade humana, além de produzir – mundialmente – inúmeros embriões excedentes criopreservados, sem definição consensual acerca de seu estatuto jurídico. A partir de um estudo interdisciplinar com a contextualização dos principais termos e conceitos como vida, pessoa e dignidade, a nossa contribuição para o conhecimento e discussão cientifica no âmbito jurídico-político é admitir que o embrião in vitro não está acobertado pela dignidade humana e atribuir a natureza jurídica análoga a de aglomerado celular, material biológico ou, propriamente de coisa, até que tenha potencial ativo. Isso não impede que o uso que pode ser feito dele, seja controlado. O método fundamental de investigação é o hermenêutico. O trabalho busca fontes em diversos ramos do conhecimento como a biologia, medicina, biotecnologia, filosofia e o direito. Fez-se necessário percorrer tais disciplinas, porque o foco do problema que nos propusemos a investigar está no início da vida. Um conceito indecifrável, mas que pode ser analisado sobre diferentes perspectivas. Em particular, quando se busca compreender as diversas fases do desenvolvimento embrionário e, ao mesmo tempo, examinar as teorias filosóficas para chegar ao início moralmente relevante da vida do ponto de vista jurídico. Analisamos os argumentos éticos e jurídicos a favor e contra a utilização de embriões em pesquisas e como as legislações de diversos países se enquadram nesses posicionamentos. Buscou-se estabelecer a correlação do tratamento jurídico do embrião com a religião, valores culturais e com o histórico eugênico que marcou o passado recente, em especial, na Alemanha nazista.This thesis explores the complexity of establishing the moral and legal status of the in vitro fertilized human embryo. The research is guided by the central question whether or not to assign dignity to the in vitro human embryo. We encounter an incoherence that derives from subterfuge to at the same time protect the embryo under the cloak of dignity, while allowing it to be destroyed in research. The relevance of the research goes beyond national boundaries because in vitro fertilization (IVF) is used in almost every country in the world as the primary mechanism for solving the problems of human infertility, besides producing - worldwide - many cryopreserved surplus embryos, without consensual definition about their legal status. Performing an interdisciplinary study including a contextualization of the main terms and concepts such as life, person and dignity, our contribution to knowledge and scientific discussion in the legal-political context is to admit that the in vitro embryo is not covered by human dignity and to attribute the legal nature analogous to that of a cell cluster, biological material or a proper thing, until it has active potential. This does not prevent that the use it can be made of, to be controlled. The fundamental method of investigation is the hermeneutic. The work seeks sources in various branches of knowledge such as biology, medicine, biotechnology, philosophy and law. It was necessary to go through these disciplines, because of the research focus, early human life, an indecipherable concept, but one that can be analyzed from different perspectives. In particular, when seeking to understand the various stages of embryonic development and, at the same time, to examine philosophical theories in order to arrive at the morally relevant beginning of life from a legal standpoint. We analyze the ethical and legal arguments for and against the use of embryos in research and how the laws of many countries fit into these positions. We sought to establish the correlation of the embryo's legal treatment with religion, cultural values and the eugenic history that marked the recent past, especially in Nazi German

Unveiling aberrancies and neurotoxic properties of ALS astrocytes using unspecific and microglia-specific activation models

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa caraterizada pela perda progressiva dos neurónios motores (NMs) superiores e inferiores no Sistema Nervoso Central, nomeadamente, no cérebro, tronco cerebral e medula espinal. A perda de NMs resulta numa paralisia extensa que começa localmente na musculatura dos membros superiores, inferiores ou bulbar. A ELA é uma doença fatal, com uma sobrevida normalmente de 2 e 5 anos após o diagnóstico. Os doentes sucumbem à doença devido a atrofia muscular grave, paralisia e por fim a desenervação dos músculos respiratórios. É uma doença extremamente heterogénea na sua sintomatologia, e com uma patogénese pouco clara. Atualmente, existem apenas duas abordagens terapêuticas muito limitadas quanto à sua eficácia, tornando-se premente compreender as causas subjacentes e os fatores de risco, de forma a encontrar novos alvos terapêuticos para a ELA. Apesar do envolvimento dos NMs, é bem conhecida a importância da disfuncionalidade das células gliais na doença. Na ELA, os astrócitos alteram a sua forma e padrões de expressão molecular e são referidos como astrócitos reativos ou ativados, perdendo as suas funções benéficas e adquirindo papéis prejudiciais. No entanto, não se sabe qual a causa de tal reatividade e do fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA, ou seja, se são intrínsecos à patologia, se são potenciados pela libertação de citocinas da microglia ativada, ou se pelo ambiente neuroinflamatório e seus mediadores. Esta tese teve a possibilidade única de explorar a morfologia e assinatura inflamatória de astrócitos diretamente convertidos de fibroblastos (iAstrócitos) de uma doente com forma esporádica da ELA, em comparação com uma amostra controlo obtida da mesma forma, de uma pessoa não doente, do mesmo sexo e idade (controlo). Para tornar mais evidente as reações de patogenicidade dos astrócitos ELA, foram usados dois estímulos inflamatórios diferentes, ambos descritos na literatura e envolvendo a ação de citoquinas pró-inflamatórias, para atestar qual o mais eficaz na indução do fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA. Usámos células induzidas percursoras neurais geradas de fibroblastos da doente e respetivo controlo, cedidas por Kathrin Meyer no âmbito da nossa colaboração, que foram diferenciados em astrócitos induzidos (iAstrócitos), durante 7 dias in vitro. Os astrócitos foram de seguida incubados com as citocinas da microglia ativada (TNF-α/IL-1α/C1q) e as associadas a qualquer processo inflamatório (TNF-α/IL-1β) durante 48 horas. Após este período, recolheram-se as células e o seu secretoma. Os astrócitos da doente com ELA exibiram menos células polarizadas, maior aparência de fibroblastos e menor soma, quando comparados com a amostra controlo, se bem que sem evidência estatística. Esta tendência manteve-se após estimulação com TNF-α/IL-1α/C1q, mas não totalmente com TNF-α/IL-1β, dado que neste caso apenas se verificou a presença de menor soma. A avaliação das propriedades dinâmicas da mitocôndria nos astrócitos, permitiu evidenciar uma diminuição marcada nos astrócitos ELA que se tornaram menos evidentes com TNF-α/IL-1α/C1q e ausentes com TNF-α/IL-1β. Contrariamente ao descrito para os genes associados ao fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA, não observámos nos astrócitos ELA o aumento de Cx43, nem de S100B, os quais se apresentaram diminuídos (p<0.01 para ambos), nem qualquer alteração para o transcrito GFAP, habitualmente reduzido. Contudo, identificámos um aumento do marcador de proliferação celular, o Ki-67 (p<0.05). Na presença de TNF-α/IL-1α/C1q, tanto o GFAP como o S100B foram encontrados diminuídos (p<0.05) nos astrócitos ELA. O S100B foi igualmente encontrado diminuído na presença de TNF-α/IL-1β que levou a um aumento marcado da proliferação nos astrócitos ELA. A avaliação de S100B por imunocitoquímica, confirmou a diminuição de S100B nos astrócitos ELA na presença tanto de TNF-α/IL-1α/C1q, como de TNF-α/IL-1β (p<0.05), mas não na ausência destes estímulos. Quanto aos marcadores inflamatórios associados à ativação do inflamassoma, NLRP3, IL1R1 e IL-1β, há a salientar a diminuição dos genes IL-1β e NLRP3 nos astrócitos ELA não estimulados. A redução do NLRP3 foi sustentada na presença de qualquer um dos modelos de estimulação. Os resultados obtidos para os astrócitos da doente com a forma esporádica da ELA apresentam alterações fenotípicas relativamente à amostra controlo, sugestivas de latência e menor capacidade reativa a estímulos, mas mantendo um aumento da capacidade proliferativa, na ausência e presença de TNF-α/IL-1β. Quanto aos efeitos dos dois estímulos testados, nem sempre foram comparáveis. Este trabalho foi pioneiro em mostrar déficits de uma amostra de astrócitos obtidos de doente com ELA, os quais necessitam, contudo, de ser reforçados com um maior número de amostras, incluindo formas familiares. Em suma, o processo inflamatório deverá ser tido em conta na avaliação da patologia associada à ELA e os iAstrócitos sobressaem como uma ferramenta importante na medicina personalizada para esta doença.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterised by the progressive loss of upper and lower motor neurons (MNs) in the central nervous system, namely in the brain, brainstem and spinal cord.The loss of MNs results in extensive paralysis starting locally in the muscles of the upper, lower or bulbar limbs. ALS is a fatal disease, with survival typically between 2 and 5 years after diagnosis. Patients succumb to the disease due to severe muscle atrophy, paralysis, and ultimately the denervation of the respiratory muscles. It is an extremely heterogeneous disease in its symptomatology, and with an unclear pathogenesis. Currently, there are only two therapeutic approaches that are very limited in their efficacy, making it urgent to understand the underlying causes and risk factors in order to find new therapeutic targets for ALS. Despite the involvement of MNs, the importance of glial cell dysfunctionality in the disease is well known. In ALS, astrocytes change their shape and molecular expression patterns and are referred to as reactive or activated astrocytes, losing their beneficial functions and acquiring detrimental roles. However, it is not known what causes such reactivity and the aberrant phenotype of astrocytes in ALS, i.e., whether they are intrinsic to the pathology, whether they are potentiated by cytokine release from activated microglia, or whether by the neuroinflammatory environment and its mediators. This thesis had the unique possibility to explore the morphology and inflammatory signature of astrocytes directly converted from fibroblasts (iAstrocytes) from a patient with the sporadic form of ALS, compared to a control sample obtained in the same way, from a non-diseased person of the same gender and age (control). To make the pathogenicity reactions of ALS astrocytes more evident, two different inflammatory stimuli were used, both described in the literature and involving the action of pro-inflammatory cytokines, to test which was more effective in inducing the aberrant phenotype of astrocytes in ALS. We used induced neural precursor cells generated from patient and control fibroblasts, provided by Kathrin Meyer within our collaboration, which were differentiated into induced astrocytes (iAstrocytes) for 7 days in vitro. The astrocytes were then incubated with the cytokines of activated microglia (TNF-α/IL-1α/C1q) and those associated with any inflammatory process (TNF-α/IL-1β) for 48 hours. After this period, the cells and their secretome were collected. Astrocytes from the ALS patient exhibited fewer polarised cells, greater fibroblast appearance and lower soma, when compared to the control sample, although without statistical evidence. This trend was maintained after stimulation with TNF-α/IL-1α/C1q, but not entirely with TNF-α/IL-1β, as only lower soma was present in this case. Assessment of the dynamic properties of mitochondria in astrocytes, provided evidence of a marked decrease in ALS astrocytes that became less evident with TNF-α/IL-1α/C1q and absent with TNF-α/IL-1β. Contrary to what has been described for genes associated with the aberrant astrocyte phenotype in ALS, we did not observe in ALS astrocytes increased Cx43, nor S100B, which were decreased (p<0.01 for both), nor any change for the usually reduced GFAP transcript. However, we identified an increase in the cell proliferation marker, Ki-67 (p<0.05). In the presence of TNF-α/IL-1α/C1q, both GFAP and S100B were found decreased (p<0.05) in ALS astrocytes. S100B was also found decreased in the presence of TNF-α/IL-1β which led to a marked increase in proliferation in ALS astrocytes. Evaluation of S100B by immunocytochemistry, confirmed the decrease of S100B in ALS astrocytes in the presence of both TNF-α/IL-1α/C1q and TNF-α/IL-1β (p<0.05), but not in the absence of these stimuli. As for the inflammatory markers associated with inflammasome activation, NLRP3, IL1R1 and IL-1β, one should note the decrease in IL-1β and NLRP3 genes in unstimulated ALS astrocytes. The reduction in NLRP3 was sustained in the presence of either stimulation model. The results obtained for astrocytes from the patient with the sporadic form of ALS show phenotypic changes in relation to the control sample, suggestive of latency and lower reactive capacity to stimuli, but maintaining an increased proliferative capacity, in the absence and presence of TNF-α/IL-1β. As for the effects of the two stimuli tested, they were not always comparable. This work was pioneering in showing deficits in a sample of astrocytes obtained from an ALS patient, which need, however, to be reinforced with a larger number of samples, including familial forms. In summary, the inflammatory process should be considered in the assessment of ALS-associated pathology and iAstrocytes stand out as an important tool in personalised medicine for this disease.Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa; Santa Casa da Misericórdia de Lisboa (SCML), Portugal; Project ref. ALS-Research Grant ELA-2015-002; La Caixa Foundation; Fundación Luzón; Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)

Validação das medidas de controlo de produtos perecíveis na fase de preparação de cargas para máquinas de vending

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar, área científica de Produção Animal e Segurança AlimentarA temperatura de distribuição de alimentos é um dos fatores mais importantes a serem controlados para evitar doenças transmitidas por alimentos em serviços de alimentação. Este estudo consiste na avaliação da variação de temperaturas dos alimentos, desde o acondicionamento dos produtos nas arcas de refrigeração até ao abastecimento nas viaturas de distribuição. O principal objetivo deste trabalho é validar os procedimentos que estão atualmente implementados na empresa. Pretende-se verificar se são eficazes e asseguram que os produtos não ultrapassam por demasiado tempo (superior a 2 horas) a temperatura máxima de conservação/transporte exigida, para os produtos perecíveis os 5ºC, para saladas os 4ºC e para os gelados os ≤-18ºC, desde a saída das câmaras de refrigeração/congelação até à entrada nos veículos de distribuição (que estão a temperatura controlada). Neste intervalo de tempo, os produtos mantêm-se no cais/armazém à temperatura do ar ambiente (em caixas isotérmicas e em caixas de transporte), o que exige um processo rápido, de forma a evitar a quebra da cadeia de frio evitando possíveis alterações indesejadas no produto. Um outro objetivo deste trabalho foi o apurar as causas e as consequências das variações de temperatura, bem como analisar o impacto das ações corretivas a implementar numa perspetiva logística. Assim, a medição das variações térmicas foi efetuada em diferentes pontos da caixa isotérmica, utilizando para o efeito um equipamento amovível de medição e registo de temperatura (data logger). Os alimentos frescos evidenciavam-se pela sua perecibilidade, pelo facto de a sua ser definida pela aparência fresca e por estarem associados à imagem dos estabelecimentos de distribuição onde são comercializados. Consequentemente, para que o consumidor possa confiar na qualidade e segurança do alimento, é essencial assegurar as boas práticas de manuseamento e conservação dos mesmos. O estudo confirmou que as metodologias de controlo de temperatura implementadas pelo Sistema de Gestão e Segurança Alimentar (SGSA) são eficazes para garantir a qualidade e a segurança dos produtos durante a expedição. A cadeia de frio foi mantida, e a qualidade percebida pelos consumidores permaneceu dentro dos padrões exigidos. No entanto, foram identificadas áreas de melhoria que podem otimizar ainda mais o processo logístico, garantindo maior eficiência e minimizando os riscos de quebras de temperatura em condições operacionais adversasABSTRACT - Validation of Control Measures for Perishable Products in the Load Preparation Phase for Vending Machines - The distribution temperature of food is one of the most important factors to be controlled to prevent foodborne illnesses in food service operations. This study consists of evaluating the variation in food temperatures, from the storage of products in refrigeration units to their loading onto distribution vehicles. The main objective of this work is to validate the procedures currently implemented in the company. The aim is to verify whether they are effective and ensure that the products do not exceed the maximum conservation/transport temperature required for too long (more than 2 hours). For perishable products, this limit is 5°C, for salads 4°C, and for ice creams ≤-18°C, from the moment they leave the refrigeration/freezing chambers until they are loaded into the distribution vehicles (which are temperature-controlled). During this interval, the products remain on the dock/warehouse at ambient air temperature (in thermal boxes and transport containers), requiring a quick process to avoid breaking the cold chain and preventing potential undesirable changes to the product. Another objective of this work was to determine the causes and consequences of temperature variations, as well as to analyze the impact of corrective actions to be implemented from a logistical perspective. Thus, temperature variations were measured at different points within the thermal box using a portable temperature measurement and recording device (data logger). Fresh foods stood out for their perishability, as their quality is defined by their fresh appearance and their association with the image of the distribution establishments where they are sold. Consequently, to ensure that consumers trust the quality and safety of the food, it is essential to maintain good handling and storage practices. The study confirmed that the temperature control methodologies implemented by the Food Safety and Management System (FSMS) are effective in ensuring the quality and safety of the products during shipment. The cold chain was maintained, and the quality perceived by consumers remained within the required standards. However, areas for improvement were identified that could further optimize the logistical process, ensuring greater efficiency and minimizing the risks of temperature breaches under adverse operational conditionsN/